[發明專利]與CRM197有關的方法和組合物

在審

• 申請號: 201380073162.1
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN105263527A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: J.伊森;M.科瓦里克;L.C.特尼-邁爾
• 申請（專利權）人: 格林考瓦因有限公司;聯邦材料試驗研究院
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;C07K14/34;C12N15/73
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;彭昶

1.一種產生CRM197的方法，其中所述方法包括培養包含編碼CRM197的核酸的大腸桿菌細胞，其中CRM197融合至異源信號肽，所述異源信號肽將CRM197靶向所述大腸桿菌細胞的周質。

2.權利要求1的方法，其中所述CRM197的野生型信號肽已缺失。

3.權利要求1的方法，其中所述CRM197的野生型信號肽已替換為所述異源信號肽。

4.權利要求1的方法，其中所述異源信號肽選自來自下述的信號肽：大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌外膜孔蛋白（OmpA）、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白（MalE）、胡蘿卜軟腐歐文菌果膠酸裂解酶（PelB）和芽孢桿菌屬物種木聚糖內切酶（XynA）。

5.權利要求1的方法，其中CRM197以至少5、10、25、50、75、100、125、125、150、175、200、225、250、300、400、500、600、700、800、900或至少1000mg蛋白質/升培養基的濃度產生。

6.權利要求1或5的方法，其中如通過圓二色性測定的，至少50%的所述生產的蛋白質是正確折疊的。

7.權利要求1或5的方法，其中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.8%或至少99.9%的所述生產的蛋白質是正確折疊的。

8.權利要求1或5的方法，其中至少50%的所述生產的蛋白質不以聚集體存在。

9.權利要求1或5的方法，其中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.8%或至少99.9%的所述生產的蛋白質不以聚集體存在。

10.權利要求1或5的方法，其中至少50%的所述生產的蛋白質是可溶性的。

11.權利要求1或5的方法，其中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.8%或至少99.9%的所述生產的蛋白質是可溶性的。

12.權利要求1或5的方法，其中所述異源核苷酸序列編碼在將CRM197靶向周質的信號肽和CRM197蛋白質之間的切割位點，其中所述切割位點包含氨基酸序列aa1-aa2-aa3-（切割位點）-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8，其中

aa1選自Ala、Ser、Gly、Cys、Thr和Gln；

aa2選自任何天然氨基酸；

aa3選自除了Phe、His、Tyr、Trp、Asp、Glu、Lys、Arg、Asn和Gln之外的任何天然氨基酸；

aa4至8選自ala-asp-asp-val和gly-ala-asp-asp和met-gly-ala-asp；

或其中切割位點包含氨基酸序列aa1-aa2-aa3-（切割位點）-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8，其中

aa4至8選自ala-asp-asp-val和gly-ala-asp-asp和met-gly-ala-asp；并且其中

開放讀碼框的前70個aa導致當通過SignalP4.0Server分析時超過0.72的Y得分。

13.權利要求1或5的方法，其中所述異源核苷酸序列編碼SEQIDNO:1或2的蛋白質。

14.權利要求1或5的方法，其中所述異源核苷酸序列可操作地連接至選自下述的啟動子：L-阿拉伯糖誘導型araBAD的啟動子（PBAD）、lac啟動子、L-鼠李糖誘導型rhaPBAD啟動子、T7RNA聚合酶啟動子、trc啟動和tac啟動子、λ噬菌體的啟動子pL、和脫水四環素誘導型tetA啟動子/操縱子。

15.權利要求1或5的方法，其中將所述編碼CRM197的核酸插入高拷貝表達質粒中。

16.權利要求15的方法，其中所述高拷貝表達質粒是pEC415、pBR322、pBAD、pET系列、pUC系列、pACT3、pEXT22、pEXT20、pBLUESCRIPT系列、pGEM系列。