[發明專利]編碼具有人獨特型的嚙齒動物抗體的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的動物

有效

• 申請號: 201380070457.3
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN104994729B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: M·布魯格曼;R·布洛夫;M·J·奧斯伯恩;B·馬
• 申請（專利權）人: OMT公司
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C07K16/00;C12N15/85
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

本發明涉及可用于在嚙齒動物中優化產生具有人獨特型的功能性免疫球蛋白的多核苷酸，尤其是嵌合多核苷酸。本發明還涉及包含此類多核苷酸的嚙齒動物。

相關申請的交叉引用

本申請要求2012年12月14日提交的美國臨時專利申請U.S.S.N.61/737,371的優先權。本申請明確地以全文引用的方式并入本文中。

發明領域

本發明涉及可用于在嚙齒動物中產生具有人獨特型的免疫球蛋白的多核苷酸，尤其是嵌合多核苷酸。本發明還涉及包含此類多核苷酸的嚙齒動物細胞。

參考序列表

在此專利文件中，以在2012年12月12日創建(大小3MB)并且命名為“189314-US_ST25.txt”的txt文件提供序列表。此文件的內容以全文引用的方式并入本文中。

發明背景

已證明人單克隆抗體在治療應用中作為常規大小的IgG、單鏈或者結構域模塊是無價的^1,2。盡管成功，但在它們的產生中仍然存在著主要缺點，其依賴于可獲得的人材料的特異性選擇以及個體產物的后續修飾，或者轉基因動物(主要是小鼠)的有限可用性的免疫³。靶抗原限制對轉基因小鼠以及大的轉基因動物(例如牛)的使用而言普遍是適當的，而新的特異性的開發是受公司控制的^4-7。

在20多年前，通過在種系構型中穩定地插入重鏈基因，開創了在轉基因小鼠中人免疫球蛋白(Ig)基因的DNA重排和表達⁸。雖然在這些早期動物中獲得了人抗體庫，但是導致人Ig的較高表達水平和專一產生的主要改進結合了兩種新策略：在胚胎干(ES)細胞中基因敲除⁹以及在人工染色體上基因座延伸¹⁰。

通過在ES細胞中基因靶向，內源性Ig基因的沉默產生若干失活小鼠系，其沒有重排它們的IgH和Igκ基因座的能力或者不產生完全功能性的IgH、Igκ或Igλ產物(總結于³)。近來設計鋅指核酸酶(ZFN)用以在Ig基因中產生位點特異性雙鏈斷裂，其通過缺失和非同源的DNA修復使得基因破壞。將ZFN質粒注入受精卵產生Ig沉默的大鼠和具有IgH和IgL破壞的兔^11-13。

抗體的有效表達需要免疫球蛋白基因座中在各種位置處的功能性調節元件。通過核酸酶消化和對降解的超敏性，已經在多個活性基因附近鑒定增強子序列。超敏位點可以在啟動子序列之前，并且它們的活性強度與該DNA序列相關。如果增強子功能存在，則與報告基因的連鎖顯現出升高的轉錄(Mundt等人，J.Immunol.，，166,3315[2001]。在IgH基因座中，已經鑒定出兩個重要的轉錄或表達調節子，即在基因座末端的Eμ和3’E(Pettersson等人，Nature，344，165[1990])。在小鼠中，整個3’調節區(包含hs3a、hs1,2、hs3b和hs4)的去除容許正常的早期B細胞發育但是消除了類別轉換重組(Vincent-Fabert等人，Blood,116,1895[2010])并且可能防止體細胞超突變的優化(Pruzina等人，Protein Engineering,Design and Selection,1,[2011])。

當使用轉基因的人IgH基因時，實現最佳的同種型表達的調節性功能是特別適合的。然而，在許多實驗室中，通常僅僅提供hs1,2元件的具有不完全3’E區的轉基因構建體，即使在內源性IgH基因座被敲除時，也導致在轉基因小鼠中令人失望的表達水平。這可能是為什么迄今為止從基因工程小鼠產生抗原特異性完全人IgG效率低的一個原因。(Lonberg等人，Nature 368,856[1994]；Nicholson等人，J.Immunol.,163,6898[1999]；Davis等人，Cancer Metastasis Rev.18,421[1999]；Pruzina等人，Protein Engineering,Design andSelection,1,[2011]。