[發明專利]分析氨基酸的方法及其所用的試劑

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• 申請號: 201380070454.X
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN105122066A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: L·J·皮特斯;M·G·帕洛特;P·瓊斯
• 申請（專利權）人: JPP色譜有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 王長青

本發明涉及一種分析含氮化合物如氨基酸等的新型方法。本發明還提供了一種用于該方法中的試劑。

氨基酸是形成蛋白質的組分，蛋白質又在許多生物學過程中起關鍵作用。在許多情況下，在個體中存在或不存在特定氨基酸可嚴重影響其健康。例如，患遺傳代謝紊亂苯丙酮尿癥的個體不能代謝苯丙氨酸；苯丙氨酸的累積會嚴重影響其大腦發育。因此，用于檢測游離氨基酸或者測定蛋白質的氨基酸組成的方法對正確的診斷和疾病管控是至關重要的。類似地，該類方法對商業藥品、食品和食物的分析以及蛋白質和酶研究及開發是重要的。更一般地，含氮化合物的檢測和識別用于寬范圍的學科應用中，包括農業、生物化學、臨床、環境、食品、法醫、組織化學、微生物、醫療、營養、植物和蛋白質科學。

目前，通常使用自動氨基酸分析儀檢測游離或水解釋放的氨基酸。Moore、Stein和Spackman在二十世紀五十年代開發了第一種自動化氨基酸分析方法(SpackmanDH，SteinWH和MooreS.，Automaticrecordingapparatusforuseinthechromatographyofaminoacids，AnalChem，1958，30：1190-1206)。該多級方法包括借助離子交換液相色譜法分離氨基酸。由試劑池泵送茚三酮試劑，與離子交換柱的洗脫液混合，并使其通過鋼或塑料反應盤管，并加熱至反應所需的溫度。

茚三酮與所有氨基酸和相關的胺化合物反應，從而形成高度顯色的反應產物。特別地，由伯胺和伯氨基酸形成Ruhemann紫，且可通過570nm波長下的光吸收測定。由仲胺和許多仲氨基酸形成黃色反應產物。這些反應產物可通過其在440nm波長下的光吸收測定。所述顯色反應產物的強度根據氨基酸濃度變化。

使氨基酸反應產物通過光度計，其中在合適的波長、特別是在570nm和440nm下檢測染料化合物吸收的光?？赏ㄟ^色譜法確定不同氨基酸的存在。各種氨基酸的識別建立在其遷移特性以及因此其在色譜圖的位置的基礎上。氨基酸的濃度通過在光度計中借助特定波長下的吸光度檢測的顯色產物的強度確定。因此，該方法可用于定性和定量確定測試樣品中存在何種氨基酸以及各自的相對濃度。

茚三酮和氨基酸或胺之間的顯色反應在室溫下非常緩慢。它在高溫下顯著更快，但仍消耗很多分鐘，即使是在130℃和更高的溫度下也如此。為了保持良好的色譜性能，所述顯色反應必須在約1分鐘或更短的時間內進行。為了獲得該性能，發現還原茚三酮(即茚三酮的還原形式)是茚三酮試劑發揮作用所必需的，且提供了可接受的反應速率。為了解釋還原茚三酮在高溫下加速形成顯色產物的能力，已提出了許多原因和機理。一種看法是還原茚三酮起一種反應中間體的穩定劑的作用。因此，它被視為促進劑而非催化劑。

遺憾的是，存在于茚三酮試劑中的還原茚三酮是非常難處理的化合物。它在空氣存在下特別不穩定，氧氣會將還原茚三酮快速氧化成茚三酮。僅需相對較少量的空氣就嚴重貧化所述試劑中的還原茚三酮，由此顯著降低光度分析中的顯色敏感度。在茚三酮試劑的制備和使用期間，可使用惰性氣氛，通常為氮氣，以試圖降低還原茚三酮的氧化?？芍獣缘氖牵瑢τ诙栊詺夥盏囊髮е滦枰獜碗s的設備和處理程序，以確保快速氨基酸分析所必需的還原茚三酮在其使用之前和/或期間不以不可接受的速率劣化。

此外，還原茚三酮不溶于完全水性的介質中。因此，其儲存和使用需要顯著量的有機溶劑。

在實踐中，在使用現有設備和技術下，在標準氨基酸分析儀上混合或使用含還原茚三酮的茚三酮試劑時不可能完全排除空氣。因此，所述試劑中的還原茚三酮濃度不可避免地穩步降低，直至在色譜分析的時間框架內不發生顯色反應。實際上，包含還原茚三酮的典型茚三酮試劑具有不長于1個月且可短達2周的貯存期限。

自從Moore、Stein和Spackman發現需要還原茚三酮的茚三酮基分析以來，在最近60年內很少變化。相反，該方法仍是目前最普遍使用的技術。然而，鑒于上述與使用還原茚三酮有關的問題，為了盡可能多地使劣化速率最小，已對該方法做了很小的改進。Moore、Stein和Spackman的原創方法使用氯化亞錫作為還原劑。然而，產生足以導致合理快速反應的還原茚三酮所需的氯化亞錫量會導致氫氧化錫化合物最終沉淀，這又會污染和堵塞流動管道。因此，很快放棄使用氯化亞錫，并研究了其它還原劑如氰化物、亞鈦鹽、硼氫化物和抗壞血酸。氰化物由于毒性問題且缺乏必要的穩定性而無法商業應用。