[發(fā)明專利]基于RCA的局部擴增方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380069202.5
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN104919057B
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 烏爾夫·蘭德格倫;陳磊;吳迪;農(nóng)園;卡羅林·加朗
• 申請（專利權）人: 歐凌科公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 北京德琦知識產(chǎn)權代理有限公司 11018
• 代理人: 康泉;王珍仙

1.一種用于進行包括至少兩輪RCA的局部RCA反應的方法，其中第二RCA反應的產(chǎn)物附著并從而局限于第一RCA反應的產(chǎn)物，所述方法包括：

(a)提供第一RCA產(chǎn)物；

(b)將探針與所述第一RCA產(chǎn)物直接或間接雜交，其中所述探針包含或提供用于第二RCA反應的引物，和

(c)使用(b)的所述RCA引物進行第二RCA反應以形成第二RCA產(chǎn)物，其中在所述反應中：

(i)所述探針和所述引物不能引發(fā)使用所述第一RCA產(chǎn)物作為模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免與所述第一RCA產(chǎn)物雜交的任何探針的置換，其中：

(A)如果所述探針包含或釋放不與所述第一RCA產(chǎn)物雜交的游離3’末端，所述探針在所述探針或引物的3’末端和所述雜交的區(qū)之間包含一個或多個經(jīng)修飾的區(qū)，所述經(jīng)修飾的區(qū)用于抑制3'核酸外切酶降解返回至與所述第一RCA產(chǎn)物雜交的所述探針的區(qū)，

(B)如果所述探針包含與所述第一RCA產(chǎn)物雜交的3’末端并且所述3’末端不是連接所需的，所述探針在所述3’末端上或其附近包含修飾，所述修飾用于抑制從探針3'末端的延伸，或

(C)如果所述探針包含與所述第一RCA產(chǎn)物雜交并且是連接所需的3’末端，所述探針在雜交的可連接的5’末端上或其附近被修飾，以包含置換阻斷區(qū)，以抑制所述探針與所述第一RCA產(chǎn)物的鏈置換，

和/或使用與所述第一RCA產(chǎn)物雜交的阻斷性寡核苷酸，以防止可能從探針的3'末端發(fā)生的任何延伸延伸進入和置換任何下游探針，以避免與所述第一RCA產(chǎn)物雜交的任何探針的置換；

(ii)維持(b)的所述RCA引物與所述第一RCA產(chǎn)物的直接或間接雜交并且，依靠所述雜交，所述第二RCA產(chǎn)物附著于所述第一RCA產(chǎn)物；

(iii)用于所述第二RCA反應的RCA模板包含在所述探針中或由所述探針提供，或被單獨提供。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述探針與存在于所述第一RCA產(chǎn)物的單體中的探針結合位點雜交或與中間核酸分子雜交，所述中間核酸分子與存在于所述第一RCA產(chǎn)物的單體中的互補序列雜交。

3.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的方法，其中步驟(a)包括產(chǎn)生第一RCA產(chǎn)物。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)同時進行。

5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)相繼地進行。

6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中重復步驟(a)、(b)和(c)一次或多次。

7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述探針包含：

(i)至少一個結合域，其包含與靶核酸分子互補的區(qū)，所述靶核酸分子為第一RCA產(chǎn)物；

(ii)引物域，其包含或能夠提供用于所述第二RCA反應的引物；和

(iii)至少一個RCA-模板互補域，其包含與用于所述第二RCA反應的環(huán)狀或可環(huán)化模板互補的區(qū)；和任選的

(iv)至少一個連接-模板域，其包含或能夠提供用于環(huán)化用于所述第二RCA的可環(huán)化模板的連接模板；和/或

(v)至少一個RCA模板域，其包含或能夠提供用于所述第二RCA反應的環(huán)狀或可環(huán)化模板；

其中所述域是分開的或重疊的。

8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述探針包含一條或多條組成型核酸鏈，和任選地一個或多個雙鏈區(qū)，其可通過分子內(nèi)雜交或通過單獨核酸鏈的分子間雜交形成。

9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述探針為線性寡核苷酸或包含所述線性寡核苷酸，并且其中2個結合域被提供在所述寡核苷酸的3'和5'末端的每一個上，并且所述探針經(jīng)雜交以使所述末端并置以便彼此直接或間接地連接，所述方法還包括將所述探針末端彼此直接或間接地連接。

10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中除非所述探針已與所述第一RCA產(chǎn)物直接或間接雜交，否則所述引物不能引發(fā)所述第二RCA反應。