[發(fā)明專利]用于CDR移植的受體框架

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380069162.4
• 申請日: 2013-02-20
• 公開（公告）號: CN104884471A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·艾斯徹
• 申請（專利權(quán)）人: 艾斯巴技術(shù)-諾華有限責任公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所 11038
• 代理人: 鄭天松

【發(fā)明背景】

單克隆抗體、其綴合物和衍生物在商業(yè)上大量地作為重要的治療劑和診斷劑。非人抗體通常在單次低劑量注射后引發(fā)患者強烈的免疫反應(yīng)(Schroff,1985Cancer?Res?45:879-85,Shawler.J?Immunol?1985135:1530-5；Dillman,Cancer?Biother?19949:17-28)。因此，研發(fā)了幾種用于減小鼠類和其它嚙齒動物抗體的免疫原性的方法以及使用例如轉(zhuǎn)基因小鼠或噬菌體展示來制造全人抗體的技術(shù)。工程設(shè)計將嚙齒動物可變區(qū)與人恒定區(qū)合并的嵌合抗體(例如Boulianne?Nature?1984312:643-6)相當程度上減少了免疫原性問題(例如LoBuglio,Proc?Natl?Acad?Sci?198986:4220-4；Clark,Immunol?Today?200021:397-402)。也工程設(shè)計人源化抗體，其中可變區(qū)本身的嚙齒動物序列被工程設(shè)計為盡可能接近人序列，同時至少保留初始的CDR，或其中將來自嚙齒動物抗體的CDR移植到人抗體的框架中(例如Riechmann,Nature1988332:323-7；US5,693,761)。兔多克隆抗體廣泛用于諸如ELISA或蛋白質(zhì)印跡的生物學分析中。多克隆兔抗體因其通常更高的親和力而常優(yōu)于多克隆嚙齒動物抗體。此外，兔時常能夠?qū)υ谛∈笾芯哂胁涣济庖咴院?或在用于噬菌體展示時不產(chǎn)生良好結(jié)合劑的抗原引發(fā)良好的抗體反應(yīng)。由于兔抗體的這些熟知的優(yōu)勢，它們將理想地用于發(fā)現(xiàn)和研發(fā)治療性抗體。這通常未進行的原因主要是由于在產(chǎn)生單克隆兔抗體中的技術(shù)挑戰(zhàn)。由于骨髓瘤樣的腫瘤在兔體內(nèi)未知，因此常規(guī)用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)不適用于兔抗體。Knight和同事們已經(jīng)進行了為表達兔抗體的細胞提供融合細胞系配偶體的創(chuàng)始工作(Spieker-Polet等人,PNAS?1995,92:9348-52)而且Pytela等人在2005年已描述了一種改善的融合配偶體細胞系(參考例如美國專利No.7429487)。然而，此技術(shù)并未廣泛傳播，因為相應(yīng)的專門技能基本上由單個研究團隊控制。文獻中有描述用于產(chǎn)生單克隆抗體的替代方法，涉及通過RT-PCR從選定的抗體表達細胞中克隆抗體，但對于兔抗體而言從未有過成功報道。

兔抗體如同小鼠抗體一樣期望在用于人治療時引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)，因此兔抗體在可臨床使用之前需要人源化。然而，由于兔和小鼠之間以及兔與人抗體之間各自的結(jié)構(gòu)差異，因此用于制造人源化嚙齒動物抗體的方法無法容易地外推用于兔抗體。舉例來說，輕鏈CDR3(CDRL3)常常比人或小鼠抗體先前已知的CDRL3更長。

現(xiàn)有技術(shù)中極少描述兔抗體的人源化方法，然而這些方法并非經(jīng)典的移植方法，其中在人受體抗體上移植非人供體的CDR。WO04/016740描述一種所謂的“表面重塑”策略。“表面重塑”策略的目標在于重塑非人框架的溶劑可及殘基以使其更類似人。本領(lǐng)域中已知如WO?04/016740中所述用于兔抗體的相似的人源化技術(shù)。WO08/144757和WO05/016950公開用于使兔單克隆抗體人源化的方法，其涉及對親本兔抗體的氨基酸序列和相似的人抗體的氨基酸序列進行比較。接著改變親本兔抗體的氨基酸序列以使其框架區(qū)的序列與相似的人抗體的等效框架區(qū)更為相似。為了獲得良好的結(jié)合能力，對于每種免疫結(jié)合劑需要個別地進行艱難的研發(fā)努力。

上述方法的潛在問題在于并非使用人框架，而是對兔框架進行工程設(shè)計以使其看起來更類似人。這種方法存在風險，即埋在蛋白核心中的氨基酸延伸仍可能包含免疫原性的T細胞表位。

迄今為止，申請人尚未確認一種通過應(yīng)用最先進的移植方法進行人源化的兔抗體。這可以由兔CDR可能與人或嚙齒動物CDR大相徑庭的事實來解釋。如本領(lǐng)域中已知，許多兔VH鏈相對于鼠類和人類對應(yīng)物而言具有額外配對的半胱氨酸。除了在cys22與cys92之間形成的保守二硫橋以外，在某些兔鏈中，在CDRH1的最后一個殘基與CDR?H2的第一個殘基之間也形成有cys21-cys79橋以及CDR間的S-S橋。除此之外，在CDR-L3中常見半胱氨酸殘基對。此外，許多兔抗體CDR不屬于任何先前已知的規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonical?structure)。尤其是CDR-L3常比人類或鼠類對應(yīng)物的CDR-L3更長。