[發(fā)明專利]付之鱟試驗的抗凝血酶III用的前處理劑及前處理方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380068652.2
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN104884952A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 相澤真紀(jì);小田俊男;明田川純
• 申請（專利權(quán)）人: 生化學(xué)工業(yè)株式會社
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48;G01N33/579;C07K5/103
• 代理公司: 北京林達(dá)劉知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及付之使用了鱟試劑的內(nèi)毒素等靶標(biāo)物質(zhì)的檢測試驗的抗凝血酶III用的前處理劑和包含該處理劑的鱟試劑盒、以及使用了它們的抗凝血酶III的前處理方法和使用了鱟試劑的內(nèi)毒素等靶標(biāo)物質(zhì)的測定方法。

本發(fā)明中，有時使用下述簡稱。

Et：內(nèi)毒素

BG：(1→3)-β-D-葡聚糖

ATIII：抗凝血酶III

背景技術(shù)

內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁外膜上的脂多糖，且己知是強(qiáng)致熱原。此外，己知的是，除了發(fā)熱以外，內(nèi)毒素還會引起休克癥狀等各種病狀。因此，從確保醫(yī)藥品等的安全性的觀點出發(fā)，注射劑等醫(yī)藥品、水、醫(yī)療器具等中的內(nèi)毒素的檢測、定量很重要。

己知的是，若革蘭氏陰性細(xì)菌感染鱟，則會引起血液凝固，該現(xiàn)象被用于內(nèi)毒素的檢測。即，可以使用鱟血細(xì)胞提取液(鱟的變形細(xì)胞溶解物，下文中也稱為“LAL”)測定內(nèi)毒素。這被稱為鱟試驗，利用存在于LAL中的各種蛋白質(zhì)(均為絲氨酸蛋白酶)的級聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)是通過內(nèi)毒素與LAL接觸而發(fā)生的。

ATIII為血液中的抗凝血因子，被用于彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等的治療。此處，由于ATIII為絲氨酸蛋白酶抑制劑，因此可抑制參與存在于LAL中的級聯(lián)反應(yīng)的蛋白質(zhì)的活性(非專利文獻(xiàn)1)。這樣，有時通過待測試樣而顯示出對于鱟試劑的抑制作用。這種抑制作用有時可通過待測試樣的稀釋來避免(非專利文獻(xiàn)2)。但是，ATIII對于鱟試劑的抑制作用極強(qiáng)，為了將ATIII制劑(注射劑)付之鱟試驗，需要稀釋64倍以上(非專利文獻(xiàn)2)。由此，若考慮鱟試劑的檢測靈敏度(校準(zhǔn)曲線的最小內(nèi)毒素濃度)，則認(rèn)為難以將鱟試驗適用于ATIII制劑(非專利文獻(xiàn)2)。實際上，關(guān)于包含ATIII的試樣，現(xiàn)在也利用兔發(fā)熱試驗進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測(非專利文獻(xiàn)1)。

非專利文獻(xiàn)1中公開了一種測定ATIII制劑的Et的方法，其特征在于，將ATIII制劑稀釋100倍，在70℃加熱20分鐘進(jìn)行前處理后，與LAL反應(yīng)，通過光散射法進(jìn)行測定。該方法的技術(shù)特征在于，為了使Et的檢測高靈敏度化，代替使用分光光度計的比濁法而采用了使用光散射測定裝置的光散射法。但是，該方法與上述同樣地必須進(jìn)行高倍率的稀釋，而且至少還存在以下的問題。

(1)作為鱟試驗的測定裝置而廣泛普及的是分光光度計，為了實施光散射法而需要另行新導(dǎo)入、使用光散射測定裝置。

(2)在日本藥典中，作為Et的光學(xué)定量法僅規(guī)定了比濁法和比色法，未規(guī)定光散射法。

另外，在專利文獻(xiàn)1中記載了下述生物體來源的試樣的Et及BG的測定方法，其特征在于，使生物體來源的試樣與堿土金屬硫酸鹽或堿土金屬鹵化物接觸，加熱進(jìn)行前處理后，付之使用鱟試劑的測定。

另外，在專利文獻(xiàn)2中記載了下述血液來源的試樣的Et及BG的測定方法，其特征在于，將生物體來源的試樣與海地美銨(hexadimethrine)化合物、堿金屬氫氧化物、非離子性表面活性劑及堿土金屬鹵化物混合，加熱進(jìn)行前處理后，付之使用鱟試劑的測定。

另外，在專利文獻(xiàn)3中記載了下述有可能含有ATIII的試樣的Et測定方法，其特征在于，使生物體來源的試樣與固定有脂多糖和/或脂質(zhì)A結(jié)合肽的載體接觸，吸附回收Et后，付之使用鱟試劑等的測定。

但是，在所有文獻(xiàn)中均未有關(guān)于下述內(nèi)容的記載：為了實施ATIII的鱟試驗，在與二價金屬鹽共存的狀態(tài)下，將ATIII供至使蛋白質(zhì)失活的處理中，進(jìn)行前處理。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：國際公開2006/080448號小冊子

專利文獻(xiàn)2：日本特開平6-70796

專利文獻(xiàn)3：日本特開2010-243342

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：內(nèi)毒素·自然免疫研究15―飛躍的自然免疫研究―(エンドトキシン·自然免疫研究15―飛躍する自然免疫研究―)、醫(yī)學(xué)圖書出版、p.27～30、2012

非專利文獻(xiàn)2：內(nèi)毒素研究12―自然免疫學(xué)的新展開―(エンドトキシン研究12―自然免疫學(xué)の新たな展開―)、醫(yī)學(xué)圖書出版、p.93～97、2009

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明要解決的問題