[發明專利]基于寡核苷酸切割及延伸-依賴性非-雜交探測的靶核酸序列的檢測

有效

• 申請號: 201380068241.3
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN104903465A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 千鐘潤;李榮祚
• 申請（專利權）人: SEEGENE株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 鄭天松

1.一種通過探測和標記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非-雜交試驗來檢測核酸試樣內的靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：

步驟(a)，使上述靶核酸序列與上游寡核苷酸及探測和標記寡核苷酸進行雜交，上述上游寡核苷酸包含與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列，上述探測和標記寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列，以及(ii)5’-標記部位，包含與上述靶核酸序列非-互補的核苷酸序列，上述3’-靶向部位與上述靶核酸序列雜交，上述5’-標記部位不與上述靶核酸序列雜交，上述上游寡核苷酸位于上述探測和標記寡核苷酸的上游；

步驟(b)，在用于切割上述探測和標記寡核苷酸的條件下，使上述步驟(a)的產物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸，上述上游寡核苷酸或其延伸鏈基于具有上述5’核酸酶活性的酶來誘導上述探測和標記寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探測和標記寡核苷酸的5’-標記部位或5’-標記部位的一部分的片段；

步驟(c)，使從上述探測和標記寡核苷酸放出的上述片段與捕捉和模板化寡核苷酸進行雜交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿著3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含與上述探測和標記寡核苷酸的5’-標記部位或5’-標記部位的一部分互補的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含與上述探測和標記寡核苷酸的5’-標記部位及3’-靶向部位非-互補的核苷酸序列，從上述探測和標記寡核苷酸放出的上述片段與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交；

步驟(d)，利用上述步驟(c)的產物及模板-依賴性核酸聚合酶來實施延伸反應，與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交的上述片段延伸并生成與上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互補的延伸鏈，并形成延伸二聚物，在上述核酸試樣內不存在上述靶核酸序列的情況下，不形成上述延伸二聚物；

步驟(e)，在存在包含與上述捕捉和模板化寡核苷酸互補的雜交核苷酸序列的雜交寡核苷酸的情況下，在規定溫度范圍內，對上述步驟(d)的產物實施解鏈分析或雜交分析，上述靶核酸序列不存在于上述核酸試樣內的情況下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸形成雜交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間的雜交物的存在的信號，在上述靶核酸序列存在于上述核酸試樣內的情況下，形成上述延伸二聚物來防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間形成雜交物，由此，不提供上述信號，上述信號通過(i)與上述雜交寡核苷酸相連接的標記、(ii)與上述捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標記、(iii)與上述雜交寡核苷酸相連接的標記及與上述捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標記或(iv)嵌入標記來提供；以及

步驟(f)，檢測用于表示在上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間存在雜交物的信號，上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間的雜交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間的雜交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。

2.根據權利要求1所述的通過探測和標記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非-雜交試驗來檢測核酸試樣內的靶核酸序列的方法，其特征在于，在雜交寡核苷酸存在的條件下實施上述步驟(d)，(i)與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交的上述片段在與上述雜交寡核苷酸進行雜交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，上述雜交寡核苷酸與上述捕捉和模板化寡核苷酸雜交的情況下，上述片段的延伸使上述雜交寡核苷酸從上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分離，對此，上述延伸二聚物的形成因基于上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間的雜交的抑制和/或基于切割的雜交寡核苷酸的消耗而防止在上述步驟(e)中形成上述雜交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之間的雜交物。

3.根據權利要求1所述的通過探測和標記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非-雜交試驗來檢測核酸試樣內的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述雜交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有包含報道分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記，上述相互作用性雙重標記位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間的雜交物的情況下的上述相互作用性雙重標記的信號和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和雜交寡核苷酸之間的雜交物的情況下的上述相互作用性雙重標記的信號互不相同的位置。