[發(fā)明專利]利用密碼子隨機(jī)化和誘變來合成基因文庫的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380064845.0
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN104955961B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方斗熹;樸相彥;李俊九;李智元
• 申請（專利權(quán)）人: 塞勒密斯株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C40B40/08;C12N15/11
• 代理公司: 北京三友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11127
• 代理人: 龐東成,李棟修

1.一種合成第二基因文庫的方法，所述方法包括：

提供編碼特定蛋白序列但具有不同的核酸堿基序列的包含隨機(jī)化密碼子的第一基因文庫；

將所述第一基因文庫片段化為核酸片段；

確認(rèn)所述核酸片段的堿基序列；和

使用密碼子隨機(jī)化的堿基序列，將堿基序列經(jīng)確認(rèn)的核酸片段重新組裝成片段化前的基因序列。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述提供步驟中，所述隨機(jī)化密碼子通過以下方式制備：將簡并密碼子插入編碼特定蛋白序列的基因序列中，從而將編碼相同蛋白的不同的核酸堿基序列組合。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述提供步驟中，所述第一基因文庫中的隨機(jī)化密碼子的基因序列的兩個(gè)末端均提供有選自由條碼標(biāo)簽序列、限制性酶識(shí)別序列和側(cè)翼序列組成的組的至少一種。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括：在所述提供步驟之后，將所述第一基因文庫中的密碼子隨機(jī)化的基因序列的數(shù)量控制在通過下一代測序能夠驗(yàn)證的數(shù)量。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述確認(rèn)步驟中，序列確認(rèn)使用下一代測序來進(jìn)行。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述重新組裝步驟包括：

使用所述密碼子隨機(jī)化的堿基序列找到所述堿基序列經(jīng)確認(rèn)的核酸片段的定位位置；和

按照所定位的位置連接具有重疊堿基序列的核酸片段。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，在所述連接步驟中，所述重疊序列的長度為20bp～80bp。

8.一種無錯(cuò)的基因文庫，其包含根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的方法制造的編碼相同蛋白但具有不同的堿基序列的基因。

9.一種從權(quán)利要求8所述的基因文庫中選擇性地?cái)U(kuò)增所需的基因序列的方法。

10.一種合成突變基因的文庫的方法，所述方法包括：

提供編碼特定蛋白序列但具有不同的核酸堿基序列的包含隨機(jī)化密碼子的基因文庫；

誘導(dǎo)所述基因文庫發(fā)生突變；

將突變的基因文庫片段化為核酸片段；

確認(rèn)所述核酸片段的堿基序列；和

使用密碼子隨機(jī)化的堿基序列，將堿基序列經(jīng)確認(rèn)的核酸片段重新組裝成片段化前的基因序列。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，在所述誘導(dǎo)步驟中，所述突變是隨機(jī)突變。

12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，在所述誘導(dǎo)步驟中，所述突變通過誘變擴(kuò)增來進(jìn)行。

13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述誘變擴(kuò)增是易錯(cuò)PCR。

14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述突變基因的文庫是編碼在特定位置具有突變氨基酸的蛋白的不同的堿基序列的簇。

15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述突變基因的文庫是編碼在整個(gè)氨基酸區(qū)域中具有隨機(jī)突變的蛋白的不同的堿基序列的簇。

16.一種按照權(quán)利要求10～15中任一項(xiàng)所述的方法制造的突變基因的文庫。

17.一種從權(quán)利要求16所述的突變基因的文庫中選擇性地?cái)U(kuò)增所需的基因序列的方法。