[發明專利]在等位基因特異性PCR中具有經修飾的磷酸酯和堿基的引物

在審

• 申請號: 201380064802.2
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN104838015A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: S.弗勒納;D.海因德爾;D.凱斯勒;N.舍恩布倫納;A.詹
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李慧惠;黃希貴

1.靶序列變體的等位基因特異性擴增的方法，所述靶以數個變體序列的形式存在，所述方法包括：

（a）將第一寡核苷酸和第二寡核苷酸與靶序列的至少一個變體雜交；其中所述第一寡核苷酸至少部分地與靶序列的一個或多個變體互補，并且所述第二寡核苷酸至少部分地與靶序列的一個或多個變體互補，并且具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在環外氨基處共價修飾的堿基的核苷酸和經修飾的磷酸酯兩者，所述磷酸酯具有結構：

其中A和B代表核苷酸鏈，D是OH或CH₃，并且Acc是電子受體或被殘基R取代的電子受體，其中R是有機取代基，其中Acc選自CN、SO₂-R'，其中R'?包括至少一個氨基取代的烷基、任選取代的芳基或任選取代的雜環、和在鄰位或對位具有至少一個烷基化N-原子的六元N⁺?雜環，所述雜環選自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；

（b）提供適合用于通過核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的條件；

（c）通過所述核酸聚合酶延伸所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸，其中當所述第二寡核苷酸與和所述至少一個選擇性核苷酸互補的靶序列的變體雜交時，所述核酸聚合酶能夠有效地延伸所述寡核苷酸，并且當所述第二寡核苷酸與不和所述至少一個選擇性核苷酸互補的靶序列的變體雜交時，所述核酸聚合酶延伸所述寡核苷酸的效率實質上較低。

2.權利要求1的所述方法，其中所述至少一個選擇性核苷酸位于3`端核苷酸。

3.權利要求1的所述方法，其中具有在環外氨基處共價修飾的所述堿基的所述核苷酸出現在相對于3`-端核苷酸-5、-4、-3、-2或-1位置。

4.權利要求3的所述方法，其中在環外氨基處共價修飾的所述堿基選自N⁶-苯甲基-腺嘌呤、N⁶-對-叔丁基-苯甲基腺嘌呤、N⁴-對-叔丁基-苯甲基胞嘧啶、N⁴-乙基-胞嘧啶和N⁴-苯甲基-胞嘧啶。

5.權利要求1的所述方法，其中所述經修飾的磷酸酯出現在相對于3`-端核苷酸的-5和-4位置的核苷酸之間、相對于3`-端核苷酸的-4和-3位置的核苷酸之間、相對于3`-端核苷酸的-3和-2位置的核苷酸之間、相對于3`-端核苷酸的-2和-1位置的核苷酸之間、以及相對于3`-端核苷酸的-1位置的核苷酸和3`-端核苷酸之間。

6.權利要求5的所述方法，其中所述經修飾的磷酸酯選自P(=NSO2PhNHAc)、P=pPh-NAc、P(=N-SO₂-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe₂)和P=NS(O)2-羅丹明-B。

7.權利要求6的所述方法，其中所述經修飾的磷酸酯是P(=NSO2PhNHAc)。

8.權利要求1的所述方法，其中所述靶序列變體是人EGFR?基因的突變。

9.權利要求8的所述方法，其中所述第二寡核苷酸選自SEQ?ID?NO:?7、13、14、22。