[發明專利]蛋白綴合物

在審

• 申請號: 201380064408.9
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN104837856A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 詹卡洛·托農;加埃塔諾·奧爾西尼;魯道夫·施雷普菲爾
• 申請（專利權）人: 拜歐-克爾有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;A61K47/48
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 李平;鄭霞

發明領域

本發明涉及適于產生具有改進的血漿半衰期的藥物的綴合肽的領域。特別地，本發明涉及通過經由微生物谷氨酰胺轉移酶(MTGase)的酶促反應獲得的綴合蛋白、和用于制備高度純的綴合蛋白的改進的方法，所述高度純的綴合蛋白沒有產物衍生的降解并且呈現出改進的儲存期。

現有技術

與生物相容的、高分子量的聚合物綴合是用于增加治療肽或蛋白的半衰期和用于改進其持久性效果的最常用技術之一。特別地，在已經被廣泛利用的所謂的聚乙二醇化反應中，將選擇的蛋白共價地結合至具有從1,000-2,000道爾頓(Da)至20,000-40,000Da或甚至更高的分子量的一種或更多種線性的或支化的聚乙二醇(PEG)鏈。通常，聚乙二醇化蛋白示出較低的腎清除率、以及較高的穩定性和減少的免疫原性。當多肽與PEG合適地結合時，其流體力學體積增加并且其物理化學性質被修改，而諸如體外活性或受體識別的基本的生物學功能可以保持不變、經歷減少或在一些情況下完全被根除。PEG綴合掩蔽了蛋白表面并且增加其表觀分子尺寸，因此減小腎超濾，防止與抗體或抗原呈遞細胞(antigen?processing?cell)相互作用并且減少蛋白水解降解。最后，PEG綴合向聚乙二醇化分子賦予其物理化學性質并且因此肽和非肽藥物生物分布和溶解度也被修改。用于蛋白綴合的另一選擇(作為PEG的替代方案)是利用其它線性的或支化的生物相容性聚合物，諸如例如右旋糖酐、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(丙烯酰嗎啉)、聚多糖等等。

聚乙二醇化通常通過氨基酸反應性側鏈和合適地官能化的甲氧基-PEG(m-PEG)之間的化學反應來進行。

通常利用的化學聚乙二醇化技術在以下出版物中描述：

-S.Zalipsky,Chemistry?of?Polyethylene?Glycol?Conjugates?with?Biologically?Active?Molecules,Adv.Drug?Deliv.Rev.,16，157-182，1995；

-F.M.Veronese,Peptide?and?Protein?PEGylation:a?Review?of?Problems?and?Solutions,Biomaterials,22，405-417，2001。

-S.M.Kunstelj,V.G.Porekar,PEGylation?of?therapeutic?proteins,Biotechnol.J.5，113–128，2010。

除了化學聚乙二醇化之外，結合m-PEG鏈和蛋白的酶促程序已經被描述。例如，這些基于利用原核和真核起源兩者的谷氨酰胺轉移酶類以催化將用伯氨基官能化的m-PEG轉移至感興趣的多肽鏈中天然存在的或通過位點特異性誘變反應插入的谷氨酰胺殘基的酰基(H.Sato,Enzymatic?Procedure?for?Site-Specific?PEGylation?of?Proteins,Adv.Drug?Deliv.Rev.,54，487-504，2002)。

例如，EP785276和US6010871二者描述使用微生物谷氨酰胺轉移酶(MTGase)將聚合物鏈連接至在其氨基酸序列中具有至少一個谷氨酰胺殘基的肽和蛋白。在這些專利中，盡管給出了在一些模型蛋白上的單取代的實例，但不清楚的是取代是否也是位點特異性，這意指它們產生單分子形式或位置異構體的混合物，在位置異構體的混合物中，盡管被單取代，聚合物鏈與不同的谷氨酰胺結合。

在另一方面，EP2049566和US7893019二者公開通過使用MTGase的酶促反應在谷氨酰胺135處選擇性地單聚乙二醇化的新的G-CSF類似物。

然而，上文報道的專利和論文中不重視由酶促反應產生的聚乙二醇化產物的純化方法，特別地考慮到產物中污染性的殘余的MTGase的量，所述殘余的MTGase意外地仍然能夠水解綴合的PEG分子并且產生產物衍生的異質性。

正日益感到對開發允許維持穩定的治療性蛋白(therapeutic?protein)的方法的需求和重要性。

因此，本發明的目的是開發允許減少在綴合反應之后存在并且在其儲存期間降解綴合的藥物的殘余的MTGase污染物的方法。

發明概述

本發明涉及通過經由微生物谷氨酰胺轉移酶(MTGase)的酶促反應獲得的綴合蛋白，其特征在于以下事實：在純化的產物中殘余的MTGase的含量不高于3p.p.m，所述綴合蛋白在2℃至8℃范圍內的溫度下呈現出至少36個月的儲存期。