[發明專利]內含肽修飾的蛋白酶、其制備方法和工業用途

有效

• 申請號: 201380063222.1
• 申請日: 2013-10-03
• 公開（公告）號: CN104822830B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: R·M·萊布;B·沈;G·拉扎爾;H·德拉維加
• 申請（專利權）人: 谷萬達公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/06;C12N9/64
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 嚴政;李婉婉

1.一種制劑，該制劑含有內含肽修飾的蛋白酶的第一部分和第二部分以及洗滌劑；

第一部分，所述第一部分具有靶蛋白酶的N-外顯肽和內含肽的N-內含肽，且N-外顯肽的羧基末端與N-內含肽的氨基末端融合，其中，所述第一部分的序列如SEQ ID NO:464所示；

第二部分，所述第二部分具有內含肽的C-內含肽和靶蛋白酶的C-外顯肽，且C-內含肽的羧基末端與C-外顯肽的氨基末端融合，其中，所述第二部分的序列如SEQ ID NO:484所示；并且

其中，所述洗滌劑抑制內含肽修飾的蛋白酶的反式剪接，且通過用水稀釋洗滌劑，所述內含肽能夠誘導引起內含肽修飾的蛋白酶的反式剪接，

用水稀釋的洗滌劑中洗滌劑的濃度為洗滌劑：水的比例小于或等于1：5。

2.根據權利要求1所述的制劑，其中，用水稀釋的洗滌劑中洗滌劑的誘導濃度為洗滌劑：水的比例小于或等于選自由：1：10，1：20，1:50，1:60，1:70，1：80，1:90，1：100，1：150，1：200，1：250，1：300，1：350和1：400組成的組中的一個。

3.一種包括編碼以下部分的至少一種的多核苷酸的表達盒，i)內含肽修飾的蛋白酶的第一部分，所述第一部分具有靶蛋白酶的N-外顯肽和內含肽的N-內含肽，且N-外顯肽的羧基末端與N-內含肽的氨基末端融合，其中，編碼所述第一部分的序列如SEQ ID NO:597所示；和ii)內含肽修飾的蛋白酶的第二部分，所述第二部分具有內含肽的C-內含肽和靶蛋白酶的C-外顯肽，且C-內含肽的羧基末端與C-外顯肽的氨基末端融合，其中，編碼所述第二部分的序列如SEQ ID NO:617所示；并且

所述內含肽能夠誘導引起內含肽修飾的蛋白酶的反式剪接，內含肽引起反式剪接的能力被洗滌劑抑制，且用水稀釋洗滌劑時恢復，用水稀釋的洗滌劑中洗滌劑的濃度為洗滌劑：水的比例小于或等于1：5。

4.一種宿主，該宿主經遺傳工程改造用于表達權利要求1或2所述的制劑中含有的內含肽修飾的蛋白酶的第一部分或第二部分，其中，所述宿主選自如下組成的組中：微生物細胞、哺乳動物細胞和昆蟲細胞。

5.根據權利要求4所述的宿主，其中，所述宿主選自真菌細胞。

6.根據權利要求4或5所述的宿主，其中，所述宿主為選自由：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母屬(Saccharomyces ssp.)和畢赤酵母屬(Pichia ssp.)組成的組中的微生物。

7.根據權利要求6所述的宿主，其中，所述宿主為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

8.根據權利要求6所述的宿主，其中，所述宿主為畢赤酵母(Pichia pastoris)。

9.一種調控蛋白酶活性的方法，該方法包括將內含肽修飾的蛋白酶暴露在用水稀釋的洗滌劑的誘導濃度下，引起內含肽修飾的蛋白酶的剪接，其中，洗滌劑：水的比例小于或等于1：5；

其中，所述內含肽修飾的蛋白酶是權利要求1或2所述的制劑中含有內含肽修飾的蛋白酶。

10.根據權利要求9所述的方法，還包括獲得所述內含肽修飾的蛋白酶。

11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述獲得的步驟包括通過使用編碼內含肽修飾的蛋白酶的表達盒轉化宿主而進行遺傳工程改造宿主。

12.根據權利要求9所述的方法，其中，經所述內含肽修飾的蛋白酶的剪接，所述靶蛋白酶恢復活性。