[發明專利]用于修飾的核苷酸的氧化劑

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• 申請號: 201380062894.0
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN104955960A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 托比·奧斯特
• 申請（專利權）人: 劍橋表現遺傳學有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京中博世達專利商標代理有限公司 11274
• 代理人: 申健

本發明涉及尤其是氧化劑的試劑，用于檢測修飾的胞嘧啶殘基、以及分析和/或測序包含修飾的胞嘧啶殘基的核酸。

5-甲基胞嘧啶(5mC)是充分研究的、在基因沉默和基因組穩定性中起重要作用的表觀遺傳DNA標記，并發現其富集于CpG二核苷酸中(1)。在后生動物中，5mC可通過10-11易位(TET)家族的酶被氧化成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)(2,3)。5hmC的整體水平大概比5mC的整體水平低10倍，并在組織之間變化(4)。相對高數量的5hmC(所有胞嘧啶～0.4％)存在于胚胎干(ES)細胞中，其中5hmC被認為在建立和/或維護多能性中發揮作用(2,3,5-9)。5hmC已被提議在活躍的DNA脫甲基中作為中間體，例如通過脫氨基，或經由利用TET酶進一步將5hmC氧化為5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5cC)、隨后是涉及胸腺嘧啶-DNA糖基酶(TDG)的堿基切除修復或在復制中未被保持標記(10)。然而，5hmC本身也可構成表觀遺傳標記。

在總基因組DNA中，通過包括薄層色譜法和液相色譜-串聯質譜法的分析方法檢測和定量5hmC的水平是可能的(2,11,12)。因此，映射5hmC的基因組位置迄今為止是通過富集法實現的，該富集法采用用于DNA片段的5hmC特異性沉淀的化學物質或抗體，然后對DNA片段進行測序(6-8、13-15)。這些拉下(pull-down)方法具有相對較差的分辨率(10s至100s的核苷酸)，并且只給出相對的定量信息，這在富集中有可能受到分布式偏見。可量化的5mC的單核苷酸序列已使用重亞硫酸鹽測序(BS-Seq)完成，所述重亞硫酸鹽測序利用重亞硫酸鹽介導的脫氨基作用將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，對應于這種脫氨基作用的5mC的轉化是較慢的(16)。但是，人們已經認識到，5mC和5hmC在重亞硫酸鹽反應中脫氨基都是很慢的，因此這兩個堿基不能夠被區分(17，18)。兩個相對新的和簡潔的單分子方法在單核苷酸分辨率中檢測5mC和5hmC時顯示出希望。單分子實時測序(SMRT)已經示出能在基因組DNA中檢測衍生的5hmC(19)。然而，必須對包含5hmC的DNA片段進行富集，但該富集將導致定量信息損失(19)。即使SMRT具有較低的精確度(19)，但仍可通過其檢測5mC。此外，SMRT具有相對高的測序錯誤比率(20)，且修飾的峰值呼叫(calling)是不精確的(19)，并且平臺還不能測序整個基因組。蛋白質和固態納米孔可以溶解5hmC中的5mC，并且，利用進一步的開發，有可能測序未擴增的DNA分子(21,22)。

已經報道了使用“氧化重亞硫酸鹽”測序(“oxidative?bisulfite”sequencing)(oxBS-Seq)的方法(23)在單核苷酸分辨率上對基因組DNA中的5hmC和5mC進行定量映射。這些方法涉及使用高釕酸鉀(KRuO₄)將5hmC特異性氧化為5fC。

本發明的發明人已經意識到例如為釕酸根的金屬(Ⅵ)氧基絡合物(metal(Ⅵ)oxo?complexe)在催化將多核苷酸中的5hmC殘基選擇性氧化為5fC殘基時是有用的。例如，這在“氧化重亞硫酸鹽”分析和測序的方法中可能是有用的。

一方面，本發明提供了一種識別樣本核苷酸序列中修飾的胞嘧啶殘基的方法，所述方法包括：

(ⅰ)提供包括樣本核苷酸序列的多核苷酸群體，

(ⅱ)用金屬(Ⅵ)氧基絡合物處理所述群體的第一部分，

(ⅲ)用重亞硫酸鹽處理所述群體的所述第一部分和所述群體的第二部分，然后

(ⅳ)識別對應于所述樣本核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述群體的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的殘基。

在某些實施例中，所述殘基可通過測序被識別。例如，一種識別樣本核苷酸序列中修飾的胞嘧啶殘基的方法，所述方法可以包括：

(ⅰ)提供包括樣本核苷酸序列的多核苷酸群體，

(ⅱ)用金屬(Ⅵ)氧基絡合物處理所述群體的第一部分，

(ⅲ)用重亞硫酸鹽處理所述群體的所述第一部分和所述群體的第二部分，

(ⅳ)在步驟ⅱ)和步驟ⅲ)之后，測序所述群體的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分別產生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后

(ⅴ)識別對應于所述樣本核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中的殘基。

合適的測序方法在本領域中是已知的，并在下文詳細描述。