[發明專利]兼性減毒細菌種類及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 201380058016.1
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN104838004A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: W·G·漢森;J·斯庫伯;P·M·勞爾
• 申請（專利權）人: 艾杜羅生物科技公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N1/21;A61K39/02;C12R1/01
• 代理公司: 北京市鑄成律師事務所 11313
• 代理人: 孟銳

1.一種構造細菌以使所述細菌基因組內對所述細菌的增殖必需的一個或多個基因缺失的方法，所述缺失優先在將所述細菌引入哺乳動物宿主時發生，所述方法包括：

(i)向所述細菌內引入編碼與所述細菌異源的重組酶，與優先誘導所述重組酶在所述哺乳動物宿主內表達的調控序列可操作地連接的核酸，和

(ii)在所述細菌基因組內，在對所述細菌增殖必需的基因上游引入所述重組酶的第一附著位點，并且在對所述細菌增殖必需的基因下游引入所述重組酶的第二附著位點，以致所述重組酶在所述哺乳動物宿主內表達時，催化使兩側為所述第一和第二附著位點，對所述細菌增殖必需的基因缺失的位點特異性重組事件，其中在所述位點特異性重組事件之后，所述細菌具有增殖缺陷。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細菌為細胞內病原體，并且當所述細菌在哺乳動物宿主細胞內并且最優選為兼性胞內細菌時，所述調控序列優先誘導所述重組酶的表達。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述細菌為選自以下的屬：李斯特菌屬、奈瑟球菌屬、分支桿菌屬、弗朗西斯菌屬、桿菌屬、沙門氏菌屬、志賀菌屬、耶爾森氏菌屬、布魯氏菌屬、軍團菌屬、立克次氏體屬和衣原體屬。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述細菌為單核細胞增多性李斯特菌。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述細菌為單核細胞增多性李斯特菌，其中所述單核細胞增多性李斯特菌為ΔActA/ΔInlB。

6.根據權利要求4所述的方法，其中所述調控序列包括為PrfA依賴型的單核細胞增多性李斯特菌啟動子。

7.根據權利要求6所述的方法，其中PrfA依賴型啟動子選自inlA啟動子、inlB啟動子、inlC啟動子、hpt啟動子、hly啟動子、plcA啟動子、mpl啟動子和actA啟動子。

8.根據權利要求6所述的方法，其中所述PrfA依賴型啟動子為actA啟動子。

9.根據權利要求1所述的方法，其中所述重組酶選自C31整合酶、R4整合酶、TP901整合酶、BT1整合酶、BxB1整合酶、PSA整合酶、Cre重組酶、Flp重組酶、XerC重組酶、λ整合酶、HK022整合酶、P22整合酶、HP1整合酶、L5整合酶、γδ重組酶、Tn3重組酶、gin重組酶、RV整合酶、SPBc整合酶、TG1整合酶、C1整合酶、MR11整合酶、370整合酶、K38整合酶、Wβ整合酶和BL3整合酶。

10.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一附著位點為attB位點而所述第二附著位點為attP位點。

11.根據權利要求1所述的方法，其中對所述細菌增殖必需的所述一個或多個基因包括涉及DNA復制的至少一個基因。

12.根據權利要求11所述的方法，其中涉及DNA復制的所述至少一個基因選自ori、dnaA、dnaN、gyrA、gyrB、polC、dnaE、ftsK、ftsZ、ligA、dnaG、parC、parE、holB、dnaX、SMC和ftsY。

13.根據權利要求1所述的方法，其中對所述細菌增殖必需的所述一個或多個基因是操縱子的部分，并且所述第一附著位點在整個或一部分操縱子的上游，而所述第二附著位點在整個或一部分操縱子的下游。

14.根據權利要求13所述的方法，其中所述第一附著位點在所述操縱子的上游，而所述第二附著位點在所述操縱子的下游。

15.根據權利要求1所述的方法，其中所述重組酶為Cre重組酶，所述調控序列包括actA啟動子，所述第一和第二附著位點包括loxP位點，并且兩側為所述第一和第二附著位點、對所述細菌的毒力必需的所述基因涉及DNA復制。

16.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一和第二附著位點位于長度為約20kb或更小的核酸序列的側面。

17.根據權利要求16所述的方法，其中所述核酸序列的長度為約10kb或更小。

18.根據權利要求16所述的方法，其中所述核酸序列的長度為約6kb。