[發(fā)明專利]檢測(cè)野生型和/或突變的靶DNA序列的方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380056413.5
• 申請(qǐng)日: 2013-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN104755633A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 弗朗西斯卡·豐塔納;尼科洛·馬納雷西
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 硅生物系統(tǒng)股份公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

1.一種用于從DNA序列的文庫(kù)中檢測(cè)至少一種第一靶DNA序列和至少一種第二靶DNA序列中的至少一種的方法，其中所述第一靶DNA序列不同于所述第二靶DNA序列之處在于所述第二序列中的單個(gè)或多個(gè)核苷酸取代或刪除或插入產(chǎn)生限制性核酸內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)，包括以下步驟：

(a)提供DNA序列的所述文庫(kù)，每種所述DNA序列從5'端至3'端分別包含具有15～50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的第一序列片段，由所述限制性核酸內(nèi)切酶切割的基因組DNA的第二序列片段，以及第三序列片段，所述第三序列片段與所述第一序列片段和如果存在的話由所述限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5'懸垂物的結(jié)合物反向互補(bǔ)；

(b)通過使用以下各項(xiàng)的PCR擴(kuò)增DNA序列的所述文庫(kù)：

-與至少一種第一或第二靶序列正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的至少一種第一反向引物；

-與至少一種第一靶序列反正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的至少一種第二正向引物；

-包含與至少第二靶序列反正鏈的第三序列片段的5'端區(qū)雜交的第一部分和與至少一種第二靶序列反正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的第二部分的至少一種第三正向引物，其中所述至少一種第三正向引物的第一部分具有相對(duì)于所述至少一種第三正向引物的總長(zhǎng)度20％～80％的長(zhǎng)度；

(c)檢測(cè)步驟(b)中擴(kuò)增的DNA序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)進(jìn)一步使用與所述至少一種第二靶序列正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的至少一種第四反向引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中DNA序列的所述文庫(kù)通過確定性限制性位點(diǎn)全基因組擴(kuò)增而獲得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(c)通過DNA測(cè)序方法實(shí)施。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述DNA測(cè)序方法是桑格測(cè)序或合成測(cè)序。

6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種第三正向引物的第一部分具有相對(duì)于所述至少一種第三正向引物總長(zhǎng)度的40％～60％的長(zhǎng)度。

7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種第三正向引物的所述第二部分具有包含在對(duì)應(yīng)于所述限制性核酸內(nèi)切酶的一致序列減去如果存在的話由所述限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5'懸垂物并都除以2的最小值和30個(gè)堿基的最大值之間的堿基長(zhǎng)度。

8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述引物的至少一種進(jìn)一步包含并未與所述第一或第二靶序列，正或反正鏈中任一種雜交的5'端區(qū)。

9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述限制性核酸內(nèi)切酶是MseI。

10.一種試劑盒，包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的第一、第二和第三引物。

11.一種用于從DNA序列文庫(kù)中檢測(cè)至少一種第一靶DNA序列和至少一種第二靶DNA序列中至少一種的試劑盒，其中所述第一靶DNA序列不同于所述第二靶DNA序列之處在于所述第二序列中的單個(gè)或多個(gè)核苷酸取代或刪除或插入產(chǎn)生限制性核酸內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)，并且其中所述庫(kù)的每種DNA序列從5'端至3'端分別包含具有15～50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的第一序列片段，由所述限制性核酸內(nèi)切酶切割的基因組DNA的第二序列片段，以及第三序列片段，所述第三序列片段與所述第一序列片段和如果存在的話由所述限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5'懸垂物的結(jié)合物反向互補(bǔ)，包括：

-與至少一種第一或第二靶序列正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的至少一種第一反向引物；

-與至少一種第一靶序列反正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的至少一種第二正向引物；

-包含與至少第二靶序列反正鏈的第三序列片段的5'端區(qū)雜交的第一部分和與至少一種第二靶序列反正鏈的第二序列片段的3'端區(qū)雜交的第二部分的至少一種第三正向引物，其中所述至少一種第三正向引物的第一部分具有相對(duì)于所述至少一種第三正向引物總長(zhǎng)度20％～80％的長(zhǎng)度。

12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的試劑盒，用于診斷ALK或EGFR或PIK3CA突變。