[發明專利]測定實時PCR循環閾值的通用方法

在審

• 申請號: 201380051030.9
• 申請日: 2013-10-01
• 公開（公告）號: CN104662174A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: R.T.庫爾尼克
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G06F17/17;G06F19/24
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;黃希貴

背景

本公開總體涉及用于處理代表S形或生長曲線的數據的系統和方法，并且更具體地涉及用于確定實時聚合酶鏈式反應(PCR)擴增曲線中的特征性循環閾值(Ct)或彎頭值(elbow?value)或其他生長曲線中的彎頭值的系統和方法。

聚合酶鏈式反應是用于酶促合成或擴增定義核酸序列的體外方法。所述反應通常使用兩個寡核苷酸引物，其與相反鏈雜交且側接待擴增的模板或目標DNA序列。引物的延伸由熱穩定的DNA聚合酶催化。涉及模板變性、引物退火和由聚合酶延伸退火引物的重復系列的循環導致特定DNA片斷的指數累積。熒光探針或標記通常用于過程中，以便于擴增過程的檢測和定量。

具體而言，同質(homogeneous)且在擴增開始或物理采樣反應用于分析后不需要添加試劑的熒光技術是有吸引力的。示例性同質技術使用定位目標區域的寡核苷酸引物和用于生成信號的熒光標記或染料。典型的基于PCR的方法使用具有兩個相互作用的發色團的FRET寡核苷酸探針(相鄰的雜交探針，TaqMan探針，分子信標，Scorpions)，只具有一個熒光團的單一寡核苷酸探針(G-猝滅探針，Crockett,?A.?O.和C.?T.?Wittwer,?Anal.?Biochem.?2001;?290:89-97和SimpleProbes,?Idaho?Technology)，和使用dsDNA染料(例如，SYBR?Green?I)取代共價的、熒光標記的寡核苷酸探針的技術。PCR中結合所有雙鏈(ds)DNA的DNA結合染料引起結合后染料的熒光。因此，PCR過程中DNA產物的增加因此導致熒光強度的增加，并且在每個循環測量，從而允許DNA濃度得到定量。然而，一個潛在的缺點是與所有dsDNA?PCR產物的非特異性結合，這影響精確定量。關于標準稀釋，PCR中的dsDNA濃度可以得到測定。

熒光報道探針只檢測特異性探針結合的DNA序列，因此顯著增加特異性。這允許定量擴增物，甚至在非特異性DNA擴增存在的情況下。為了在相同反應中檢測多個目標，熒光探針可以用于多重測定中，其中具有不同顏色標記的特異性探針用于每個目標。熒光報道探針的特異性還防止引物二聚體引起的測量干擾，所述引物二聚體是在擴增過程中不期望的副產物。大多數應用基于熒光報道化合物和結合探針的熒光猝滅劑的相互作用。只要報道分子和猝滅劑化合物密切靠近，則在用激發源(例如，激光，LED等)激發后只有基礎熒光可以檢測到。一旦擴增發生，則報道分子和猝滅劑化合物的相互作用受到破壞，導致可檢測的熒光信號。在每個PCR循環擴增的產物的增加導致熒光的成比例增加，這是由于報道分子和猝滅劑化合物的相互作用減弱。通常，在每個擴增循環中檢測和測量熒光，并且其對應于產物的指數增加的幾何增加用于測定每個反應中的閾值循環(CT)。

典型的動態PCR曲線顯示于圖1A中，其中繪制了典型PCR過程的熒光強度值相對于循環數。在這種情況下，在PCR過程的每個循環中監測PCR產物的形成。擴增通常在熱循環儀中測量，其包括用于測量擴增反應過程中的熒光信號的組分和設備。此類熱循環儀的一個實例是Roche?Diagnostics?LightCycler?(目錄號20110468)。擴增產物，例如，借助熒光標記的雜交探針(所述探針只有當結合目標核酸時才發射熒光信號)來檢測，或者在某些情況下還借助結合雙鏈DNA的熒光染料來檢測。

對于典型的PCR曲線，鑒定在基線區域末端的轉變點(其通常被稱為彎頭值或循環閾值(Ct)值)對于理解PCR擴增過程的特征極為有用。Ct值可用作PCR過程的效率的量度。例如，通常對于待分析的所有反應測定定義信號閾值，并且對于目標核酸以及對于參考核酸諸如標準或持家基因測定達到該閾值所需的循環數(Ct)。目標分子(起始材料)的絕對或相對拷貝數可以基于對于目標核酸和參考核酸獲得的Ct值進行測定(Gibson等人,?Genome?Research?6:995-1001;?Bieche等人,?Cancer?Research?59:2759-2765,?1999;?WO?97/46707;?WO?97/46712;?WO?97/46714)。圖1A中在基線區域15末端的彎頭值20將在循環數30的區域內。

RNA或DNA的量可以通過將結果與已知量的RNA或DNA的連續稀釋物的實時PCR產生的標準曲線進行比較來測定。聚合酶鏈式反應(PCR)擴增中目標分子的絕對或相對拷貝數可以通過將循環閾值(Ct)值與標準曲線、與參考核酸的循環閾值(Ct)值或與絕對定量的標準核酸進行比較來測定。此外，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的效率可以通過將待分析的每個反應的循環閾值(Ct)與參考核酸的循環閾值(Ct)進行比較來測定。