[發明專利]用于核酸配對末端測序的方法、組合物、系統、儀器和試劑盒

有效

• 申請號: 201380049832.6
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN104781418B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: B·李;K·Q·勞;J·奧尼爾;J·孔克爾;K·黑利;R·卡辛斯卡斯;Z·馬;P·布若斯卡
• 申請（專利權）人: 生命技術公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所11038
• 代理人: 劉曉東

1.用于配對末端測序的方法，其包括：

(a)在附著至表面并且具有至少一個交聯部分和至少一個可切割的易切斷部分的單鏈模板多核苷酸上進行正向測序反應；

(b)在所述模板多核苷酸與和模板多核苷酸雜交的第一延伸鏈之間誘導交聯，其中所述第一延伸鏈是通過第一延伸鏈產生引物的延伸反應產生的，其中交聯是通過用化合物或用輻照處理與第一延伸鏈雜交的所述模板多核苷酸、以誘導所述模板多核苷酸上的核苷與所述第一延伸鏈的核苷之間的交聯而實現的；

(c)通過將所述易切斷部分與熱、輻照、至少一種化學品或至少一種酶進行反應來切割所述模板多核苷酸，以形成連接到所述表面上、并且與所述第一延伸鏈交聯的截短的模板多核苷酸，任選地形成末端3’磷酸基團，任選地將所述末端3’磷酸基團轉化成-OH基團，和任選地去除被切割的模板多核苷酸的部分；和

(d)在所述第一延伸鏈上進行反向測序反應。

2.權利要求1的方法，其中所述模板多核苷酸的5’末端附著至表面。

3.權利要求1或2的方法，其中所述交聯部分是光可誘導的，并且其中步驟(b)中誘導所述多核苷酸與第一延伸鏈之間的交聯是通過光化學條件實現的。

4.權利要求1或2的方法，其中所述交聯部分包括咔唑核苷。

5.權利要求1或2的方法，其中所述交聯部分包括3-氰乙烯基咔唑核苷。

6.權利要求1或2的方法，其中所述至少一個可切割的易切斷部分包括尿嘧啶堿基。

7.權利要求3的方法，其中所述交聯核苷能夠被345-375nm或350-370nm或355-365nm的光輻照。

8.權利要求1或7的方法，其中所述輻照的適當波長包括366nm。

9.權利要求1的方法，其中切割所述易切斷部分的所述至少一種酶包括糖基化酶或裂解酶。

10.權利要求1的方法，其中所述被切割的模板多核苷酸的部分通過變性來去除。

11.權利要求1的方法，其中所述正向測序反應以朝向表面的方向進行。

12.權利要求1的方法，其中所述交聯部分通過使用具有交聯部分的引物進行引物延伸反應而被摻入到所述模板多核苷酸中。

13.權利要求1的方法，其中所述模板多核苷酸是通過包括下述的引物延伸產生的：

(a)引物雜交步驟,

(b)延伸步驟,和

(c)步移步驟。

14.權利要求13的方法,

其中所述引物雜交步驟(a)包括將第一正向引物與核酸反向鏈上的互補的正向引物結合序列雜交；

其中所述延伸步驟(b)包括制備延伸的第一正向鏈，其是反向鏈的全長補體且與反向鏈雜交,所述延伸的第一正向鏈是通過使用反向鏈作為模板、以模板依賴性的方式延伸第一正向引物而制備的；

其中所述步移步驟(c)包括使第二正向引物與所述正向引物結合序列雜交，其中通過使正向引物結合序列的至少一部分從正向鏈變性、反向鏈的另一部分保持與正向鏈雜交而使所述反向鏈也與第一正向鏈雜交；

其中引物-雜交、延伸和步移步驟重復至少1次，并且在第一個擴增循環中的第二正向引物充當后一擴增循環的第一正向引物。

15.權利要求13的方法，其中所述引物延伸步驟還包括通過下述步驟延伸或擴增反向鏈：

(a)使第一反向引物與延伸的正向鏈上的互補的反向-引物結合序列雜交；

(b)通過使用正向鏈作為模板、以模板依賴性的方式延伸第一反向引物，從而制備延伸的第一反向鏈，其是正向鏈的全長補體且與正向鏈雜交；和

(c)使第二反向引物與反向引物結合位點雜交，其中正向鏈也與第一反向鏈雜交，并且任選地進行步驟(b)至(c)的一次或多次重復；

其中步驟(c)的第二反向引物是重復的步驟(b)的第一反向引物；且其中在所述一次或多次重復過程中或重復之間的所有時間時，正向鏈的大部分與反向鏈雜交。

16.權利要求13或14的方法，其中使用化學品或熱來使模板多核苷酸變性以產生單鏈核酸。