[發明專利]特異結合性或功能性蛋白的轉座介導鑒定

有效

• 申請號: 201380048308.7
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN104640985B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 烏爾夫·格勞烏德
• 申請（專利權）人: 恩比伊治療有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/90
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 區斌

1.一種獲得具有期望的靶或表位結合特異性的抗體或其片段的方法，包括以下步驟：

(i)生成多個多核苷酸的多樣化集合，所述多核苷酸編碼具有不同靶或表位結合特異性的至少10²個獨有抗體或其片段，每一編碼多核苷酸位于第一和第二末端反向重復序列之間，且所述第一和第二末端反向重復序列被至少一種轉座酶識別并作用；

(ii)將(i)所述的多核苷酸的多樣化集合引入脊椎動物宿主細胞中；

(iii)在所述脊椎動物宿主細胞中表達至少一種作用于所述末端反向重復序列的轉座酶，從而令所述多核苷酸的多樣化集合被整合到所述脊椎動物宿主細胞基因組中，以提供表達所述編碼具有不同靶或表位結合特異性的至少10²個所述抗體或其片段的多核苷酸的多樣化集合的脊椎動物宿主細胞群；

(iv)篩選所述脊椎動物宿主細胞，以識別表達具有期望的靶或表位結合特異性的抗體或其片段的脊椎動物宿主細胞；以及

(v)從所述脊椎動物宿主細胞分離出步驟(iv)中識別的編碼所述抗體或其片段的多核苷酸序列，

其中，所述步驟(ii)的多核苷酸的多樣化集合中的多核苷酸編碼：

(a)免疫球蛋白V_H和V_L區，或其抗原結合片段，其中所述V_H和V_L區序列在分開的載體上編碼，或

(b)全長免疫球蛋白重鏈和輕鏈，或其抗原結合片段，其中所述全長重鏈和輕鏈序列在分開的載體上編碼，

且其中(1)所述末端反向重復序列來自PiggyBac轉座子系統或Sleeping Beauty轉座子系統，和/或(2)步驟(iii)包括將包含編碼功能性PiggyBac轉座酶或Sleeping Beauty轉座酶的序列的載體引入所述宿主細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其中生成所述多核苷酸的多樣化集合包括：在誘變處理條件下，對V_H和/或V_L區基因序列進行PCR。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述表達步驟(iii)包括向所述宿主細胞中引入編碼轉座酶的表達載體，所述轉座酶識別并作用于至少一個末端反向重復序列，其中所述轉座酶在所述宿主細胞中瞬態表達。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述篩選步驟(iv)包含磁性激活細胞分選(MACS)、熒光激活細胞分選(FACS)、淘選固定于固體表面的分子、對與并入天然或人工重建的細胞脂質雙層膜的細胞膜相關分子的結合的選擇，或以多孔形式對個體細胞克隆進行期望功能或結合性表型的高通量篩選。

5.根據權利要求1所述的方法，其中分離出編碼具有期望的靶或表位結合特異性的所述抗體或其片段的多核苷酸序列的所述步驟(v)包括基因組擴增或RT-PCR擴增或下一代深度測序。

6.用于產生編碼具有不同靶或表位結合特異性的至少10²個抗體或其片段的多核苷酸文庫的方法，包括：

生成多個多核苷酸的多樣化集合，所述多核苷酸包含編碼具有不同靶或表位結合特異性的抗體或其片段的序列，每一編碼多核苷酸位于末端反向重復序列之間，所述末端反向重復序列被至少一個轉座酶識別并作用，

其中，所述多核苷酸的多樣化集合中的多核苷酸編碼：

(a)免疫球蛋白V_H和V_L區，或其抗原結合片段，其中所述V_H和V_L區序列在分開的載體上編碼，或

(b)全長免疫球蛋白重鏈和輕鏈，或其抗原結合片段，其中所述全長重鏈和輕鏈的序列在分開的載體上編碼；且

其中所述末端反向重復序列來自PiggyBac轉座子系統或Sleeping Beauty轉座子系統，且所述轉座酶為PiggyBac轉座酶或Sleeping Beauty轉座酶。