[發(fā)明專(zhuān)利]檢測(cè)BRAF和PI3K突變的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380047560.6
• 申請(qǐng)日: 2013-09-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104685070B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 瑪麗亞·路易莎·比利亞埃爾莫薩;胡安·莫斯科索德?tīng)柶绽?/a>
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 基諾米加公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 代理公司: 中科專(zhuān)利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 張國(guó)梁

本發(fā)明是基于在懷疑含有一種或多種BRAF突變V600E和V600K以及PI3K突變E542K，E545D，E545K和H1047R的樣品中所述突變的檢測(cè)方法，所述方法基于用本發(fā)明的引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。另外，本發(fā)明涉及用于患者病理狀態(tài)尤其是癌癥的診斷/預(yù)后的(i)試劑盒，所述試劑盒在其成分中包含擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括一種或多種本發(fā)明的引物；(ii)引物本身；和(iii)上述方法、試劑盒和引物的用途。

發(fā)明背景

B-raf(或BRAF)是Ras/Raf/MEK/MAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的部分并在調(diào)節(jié)MAP激酶/ERK信號(hào)通路中發(fā)揮作用。該基因的突變與多種癌癥相關(guān)，比如結(jié)直腸癌(CRC)，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，惡性黑色素瘤和腺癌。

在結(jié)腸癌中，已經(jīng)報(bào)道了BRAF中的致癌突變，其幾乎所有都是V600E突變(DaviesH，等人，2002，Nature 417：949-54；Rajagopalan H，等人，2002，Nature 418：934)。V600E突變位于BRAF基因的外顯子15上：在BRAF編碼序列的位置1799，T變?yōu)锳，其導(dǎo)致從存在于野生型BRAF蛋白中的纈氨酸(V)，變?yōu)榕c突變基因?qū)?yīng)的蛋白中的谷氨酰胺(E)。還檢測(cè)到V600K突變(1798-1799 GT＞AA)，但不那么大量，并且構(gòu)成病理學(xué)比如黑素瘤中量第二大的突變(Rubinstein等人，2010，Journal of Translational Medicine 8，未給出頁(yè)數(shù))。其它鑒定的BRAF基因突變是V600D，V600M和V600A。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路在很多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，所述細(xì)胞過(guò)程包括細(xì)胞增殖、粘附、存活和運(yùn)動(dòng)性。已經(jīng)在很多類(lèi)型的人惡性疾病中觀察到此通路的失調(diào)并且通常與通路成分的遺傳改變相關(guān)。此種遺傳改變包括在PI3K、PIK3CA的p110亞單位中激活突變(Hurst等人，2009，BMC Research Notes 2：66)。多數(shù)PI3K突變或者存在于PIK3CA的外顯子9(其編碼螺旋結(jié)構(gòu)域)中，或者存在于PIK3CA的外顯子20(其編碼激酶結(jié)構(gòu)域)中(Engelman，2009，Nat.Rev.Cancer 9：550-562)。上文提及的外顯子中的四種常見(jiàn)PI3K突變是E542K，E545D，E545K(它們中三個(gè)位于外顯子9中)和H1047R(外顯子20)。

近期的出版物提示，BRAF和PI3K中的突變可能對(duì)抗-EGFR治療產(chǎn)生抗性(Lurkin等人，2010，PLoS ONE，5，(1)；De Roock等人，2010，Lancet Oncol.11：753-62；De Roock等人，2011，Lancet Oncol.12：594-603；Bardelli & Sienna，2010，J Clin Oncol；28(7)：1254-1261)。特別是顯示，BRAF中突變損害患有mCRC的患者中對(duì)帕尼單抗(panitumumab)或西妥昔單抗(cetuximab)的響應(yīng)(Di Nicolantonio F等人，2008，J.Clin.Oncol.26：5705-5712)，突變BRAF的存在表示對(duì)mCRCs的消極預(yù)后因素。當(dāng)前的數(shù)據(jù)還提示，BRAF和PI3K改變的評(píng)價(jià)可能用于選擇不可能響應(yīng)抗-EGFR-靶向的抗體的患有mCRC的患者(Bardelli &Sienna，2010，J Clin Oncol；28(7)：1254-1261)。

存在高的對(duì)于檢測(cè)PI3K和BRAF基因突變的方法的需求。近來(lái)，已經(jīng)公開(kāi)了與對(duì)抗-EGFR治療的響應(yīng)相關(guān)的同時(shí)檢測(cè)基因突變的方法(Lurkin等人，2010，PLoS ONE，5，(1))。所述方法包括分析外顯子9和20中的PI3K突變，以及分析外顯子15中的BRAF突變。總的來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)兩個(gè)多重PCRs；第一個(gè)包含一對(duì)擴(kuò)增BRAF外顯子15的引物；并且第二個(gè)包含兩對(duì)擴(kuò)增PI3K外顯子9和20的引物。接著，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、變性并與探針?lè)跤鎏结樑c相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈在臨近突變位點(diǎn)的位置雜交。隨后在熱循環(huán)儀中進(jìn)行延伸反應(yīng)，其中僅互補(bǔ)于樣品中存在的突變的ddNTP被整合入延伸產(chǎn)物，并且用自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)。