[發(fā)明專利]脅迫誘導(dǎo)型衍生啟動(dòng)子

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380047042.4
• 申請(qǐng)日: 2013-09-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104781406B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 布朗溫林恩·阿倫德則-貝利;詹妮弗安·湯姆森;克什尼·伊耶;穆罕默德蘇海勒·拉富迪恩;雷維爾·伊耶;塔馬英洛倫·艾利克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 開(kāi)普敦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司44224
• 代理人: 鄭小粵

發(fā)明背景

本發(fā)明涉及通過(guò)非生物脅迫可誘導(dǎo)的衍生植物啟動(dòng)子，以及用所述非生物脅迫誘導(dǎo)性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。

非生物脅迫包括干旱、鹽度和極端溫度。這些脅迫，特別是干旱，引起農(nóng)作物生產(chǎn)重大的損失。作物耐受干旱條件的能力將是有益于降低這些損失。

PCT/IB2008/054628(公開(kāi)為WO2009/060402)中描述了在非生物脅迫條件下可誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子，將其內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文中。總的來(lái)說(shuō)，與通過(guò)組成型啟動(dòng)子的高水平轉(zhuǎn)基因表達(dá)相比，脅迫誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中具有低的基因表達(dá)水平。另一方面，發(fā)現(xiàn)從耐干燥的單子葉植物Xerophyta viscosa的基因組分離的脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子X(jué)vPSap1有效地表達(dá)。然而，XvPSap1啟動(dòng)子具有缺陷，因?yàn)樾蛄邢鄬?duì)大。大的啟動(dòng)子大小是其用于轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)中的限制因素，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因DNA序列越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率和形狀穩(wěn)定性越低。因此，這將很大程度地限制XvPSap1在生物技術(shù)應(yīng)用中的使用。

因此，對(duì)可以用于轉(zhuǎn)化作物并且其具有短于XvPSap1的長(zhǎng)度而且仍然能夠至少起到與XvPSap1同樣好的作用的非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子存在需求。

發(fā)明內(nèi)容

根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，提供了從Xerophyta viscosa分離的衍生植物啟動(dòng)子核苷酸序列，其作為通過(guò)非生物脅迫可誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子。

所述核苷酸序列可以源自Xerophyta viscose XvPSap1或可以人工合成。

衍生啟動(dòng)子片段核苷酸序列可以包括如下鑒定的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件：富TC重復(fù)序列actttctcca，attttctaac；MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或ABA-應(yīng)答原件如圖15中所說(shuō)明的。

所述核苷酸序列可以是：

(a)呈現(xiàn)出SEQ ID NO:1至3中任一個(gè)的至少80％序列同一性的核酸序列(圖1至3)；或

(b)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1至3中任一個(gè)的相反補(bǔ)體雜交的序列(圖4至6)；或

(c)SEQ ID NO:1-3中任一個(gè)的核酸序列。

優(yōu)選，所述衍生啟動(dòng)子作為非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子起作用。

更優(yōu)選，所述核苷酸序列可以具有SEQ ID NO:1至3任一個(gè)的至少85％、90％或95％同一性。

甚至更優(yōu)選，核苷酸序列可以是SEQ ID NO:1至3的任一個(gè)(圖1至3)或在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1至3中任一個(gè)的相反補(bǔ)體雜交的序列(圖4至6)并且作為非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子起作用。

所述非生物脅迫可以是滲透脅迫、脫水脅迫、干旱、鹽度、干燥或極端溫度。

雜交可以在包括約60℃至約65℃下的0.1SSC中洗滌的嚴(yán)格條件下進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含本發(fā)明啟動(dòng)子片段的核苷酸盒。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含本發(fā)明啟動(dòng)子片段的重組植物載體。

所述核苷酸盒或植物載體可以進(jìn)一步包含異源可轉(zhuǎn)錄DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，異源可轉(zhuǎn)錄DNA序列，可操作地連接啟動(dòng)子，可以是編碼目標(biāo)多肽的基因。例如，所述基因可以是耐非生物脅迫基因，其通過(guò)植物中的啟動(dòng)子表達(dá)時(shí)，提供對(duì)非生物脅迫的耐受性。更優(yōu)選，所述基因可以是XvSap1、XvPrx2、XvPer1、XvAld或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他提供非生物脅迫耐受性的基因。

在本發(fā)明可替換的實(shí)施方案中，所述基因是期望通過(guò)非生物脅迫可誘導(dǎo)地在植物中表達(dá)的任何基因。所述基因可以是植物基因或外源基因，如動(dòng)物、細(xì)菌、真菌或病毒基因。

再在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，異源可轉(zhuǎn)錄DNA序列包括轉(zhuǎn)錄成功能性RNA(如，shRNA、miRNA、siRNA、mRNA等)的目標(biāo)多核苷酸序列。

重組植物載體可以是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-衍生質(zhì)粒構(gòu)建體。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，提供了其中已經(jīng)轉(zhuǎn)化了核苷酸盒或植物載體的宿主細(xì)胞。

宿主細(xì)胞可以是植物細(xì)胞。