[發(fā)明專利]能夠產(chǎn)生腺伴隨病毒載體的細(xì)胞

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380046350.5
• 申請(qǐng)日: 2013-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN104603272B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 西江敏和;高島扶有子;榎龍嗣;峰野純一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寶生物工程株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N5/10;C12N15/09
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 李志強(qiáng),梁謀

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在基因療法的研究或臨床領(lǐng)域中特別用于將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入人體中的能夠產(chǎn)生具有高滴度的腺伴隨病毒載體的細(xì)胞。

發(fā)明背景

目前，為了治療癌癥或感染以及治療先天性遺傳疾病，進(jìn)行了使用病毒載體的基因療法的許多嘗試。在許多情況下，作為病毒載體，按慣例使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體。

腺伴隨病毒(AAV)是線性單鏈DNA病毒，可感染大范圍物種(包括人)的細(xì)胞。AAV還感染其中分化終止的不發(fā)生細(xì)胞分裂的細(xì)胞，包括血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。另外，因?yàn)锳AV對(duì)人類不是致病性的，所以具有低的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且AAV的病毒顆粒是穩(wěn)定的。出于這些原因，近來開發(fā)用于基因轉(zhuǎn)移的AAV載體在繼續(xù)進(jìn)行之中。

為了產(chǎn)生用于基因轉(zhuǎn)移的AAV載體，正如其它病毒載體一樣，在形成病毒顆粒所需要的存在于野生型AAV基因組的元件中，將需要以順式提供的元件和可以反式提供的元件分別導(dǎo)入用于病毒產(chǎn)生的細(xì)胞中和使它們在細(xì)胞中表達(dá)，因此防止在被AAV載體感染的宿主中野生型AAV的產(chǎn)生和AAV載體的自我復(fù)制(專利文獻(xiàn)1)。

用于產(chǎn)生AAV載體的已確立的常規(guī)方法包括：1)將其中保留置于野生型AAV基因組各端的ITR并剔除rep和cap基因的AAV載體質(zhì)粒導(dǎo)入，2)導(dǎo)入用于表達(dá)rep和cap基因的質(zhì)粒以便以反式提供Rep和Cap蛋白，并且，因?yàn)锳AV需要提供來自所謂輔助病毒(例如腺病毒、皰疹病毒或痘苗病毒)的補(bǔ)充元件用于形成感染性病毒顆粒，所以3)用腺病毒感染(專利文獻(xiàn)2)。

然而，通過上述方法獲得的AAV載體從理論上說被腺病毒污染。腺病毒污染物必須排除或滅活，這是造成AAV載體滴度降低的原因。另外，對(duì)將被腺病毒污染的AAV載體給予人可能引起副作用(例如腺病毒感染或炎癥)存有擔(dān)憂。因此，開發(fā)了一種用于產(chǎn)生AAV載體的方法，其包括：用以替代上述步驟3)的步驟3')導(dǎo)入在腺病毒來源的元件中只表達(dá)形成AAV病毒顆粒所必需的元件的輔助質(zhì)粒(無輔助病毒系統(tǒng)(Helper-free system)) (專利文獻(xiàn)3)。按照所述方法產(chǎn)生的AAV載體不被腺病毒污染，因此是極安全的。

另一方面，對(duì)于預(yù)期用于基因療法的研究或臨床領(lǐng)域的AAV載體的產(chǎn)生，必須獲得具有高滴度的病毒載體溶液。為此，根據(jù)來源于人的HeLa細(xì)胞或A549細(xì)胞產(chǎn)生恒定表達(dá)rep和cap基因的細(xì)胞系，并進(jìn)行了控制這些基因的表達(dá)水平的嘗試。然而，由此獲得的AAV載體沒有足夠的滴度。因此，需要用于產(chǎn)生具有較高滴度的AAV載體的方法。

引用文獻(xiàn)列表

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：USP6093570

專利文獻(xiàn)2：WO97/06272

專利文獻(xiàn)3：WO97/17458。

發(fā)明概述

本發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明的目的是提供在沒有復(fù)雜操作的情況下獲得具有高滴度的AAV載體溶液的細(xì)胞和包括使用所述細(xì)胞產(chǎn)生AAV載體的方法和試劑盒。

解決問題的技術(shù)方案

如上所述，對(duì)于預(yù)期用于基因療法的研究或臨床領(lǐng)域的AAV載體的產(chǎn)生，需要能夠產(chǎn)生具有較高滴度的AAV載體的方法。本發(fā)明人潛心研究并最終發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)生AAV載體時(shí)，通過使用表達(dá)人工導(dǎo)入的miRNA (例如hsa-miR-196a1、hsa-miR-324或hsa-miR-342)的細(xì)胞，獲得具有高于通過常規(guī)方法獲得的載體的滴度的AAV載體。因此，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明概述如下。本發(fā)明涉及：

[1] 一種能夠產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞，其中表達(dá)人工導(dǎo)入的miRNA，

[2] [1]的細(xì)胞，其中人工導(dǎo)入的miRNA是選自hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的至少一種，

[3] 一種產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞，其是導(dǎo)入了待包封入病毒中的核酸的[1]或[2]的細(xì)胞，

[4] 一種用于產(chǎn)生AAV載體的方法，所述方法包括培養(yǎng)[3]的細(xì)胞的步驟，

[5] 一種用于產(chǎn)生AAV載體的試劑盒，其包含用于提供miRNA的核酸和用于提供形成AVV載體的病毒顆粒所必需的元件的核酸，

[6] 一種通過[4]的方法可獲得的AAV載體，

[7] 一種通過在產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞中表達(dá)miRNA來選擇可引起產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞產(chǎn)生AAV載體的能力提高的miRNA的方法，所述方法包括制備表達(dá)miRNA的AAV載體的混合物的步驟和選擇在細(xì)胞中大量產(chǎn)生的AAV載體的步驟，和