[發(fā)明專利]木糖異構(gòu)酶及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380045597.5
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN104718290A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 小大衛(wèi)·尼爾·努恩;彼得·盧京比爾;李陵;亞當(dāng)·馬丁·布爾扎;約恩·彼得·弗拉施·巴特內(nèi)克
• 申請（專利權(quán)）人: BP北美公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12P7/10;C12N15/10
• 代理公司: 中原信達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219
• 代理人: 楊青;穆德駿

背景技術(shù)

從植物材料例如甘蔗有效、商業(yè)化地生產(chǎn)生物燃料需要戊糖例如木糖的發(fā)酵。植物材料中的木糖通常來自于木質(zhì)纖維素，所述木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的基質(zhì)。木質(zhì)纖維素通過酸水解或酶反應(yīng)被分解，產(chǎn)生木糖以及其他單糖例如葡萄糖(Maki等，2009,Int.J.Biol.Sci.5:500-516)。

真菌、特別是啤酒糖酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，是將糖發(fā)酵成生物燃料例如乙醇的商業(yè)上相關(guān)的微生物。然而，啤酒糖酵母(S.cerevisiae)并非內(nèi)源地代謝木糖，其需要允許它將木糖轉(zhuǎn)變成木酮糖的遺傳修飾。在乙醇生產(chǎn)中的有用性受限的其他生物體能夠代謝木糖(Nevigot,2008,Micobiol.Mol.Biol.Rev.72:379-412)。

在微生物中已鑒定到將木糖代謝成木酮糖的兩條途徑：木糖還原酶(XR，EC?1.1.1.307)/木糖醇脫氫酶(XDH，EC?1.1.1.9、1.1.1.10和1.1.1.B19)途徑，以及木糖異構(gòu)酶(XI，EC?5.3.1.5)途徑。將XR/XDH途徑用于木糖代謝引起輔因子失衡(過量的NADH和NADP+)，這限制了該途徑用于乙醇生產(chǎn)的潛在產(chǎn)量。另一方面，XI途徑在單一步驟中將木糖轉(zhuǎn)變成木酮糖，并且不引起輔因子失衡(Young等，2010,Biotechnol.Biofuels?3:24-36)。

由于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)不具有本源(native)XI，因此希望搜索另一種生物體中的XI以插入到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中，用于生物燃料生產(chǎn)目的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)種XI基因，但是共同的問題是在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)后酶活性很低或沒有酶活性。來自于梨囊鞭菌屬物種(Piromyces?sp.)E2的XI是第一種在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中異源表達(dá)的且可以觀察到酶活性的XI(WO03/062430)。

發(fā)明內(nèi)容

由于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的生理學(xué)和商業(yè)化生物燃料生產(chǎn)的過程，在商業(yè)上有用的XI中除了活性之外還存在其他有價值的特性。在發(fā)酵期間，酵母細(xì)胞及其環(huán)境的pH可以變得更加酸性(Rosa和Sa-Correia，1991，Appl.Environ.Microbiol.57:830-835)。因此，XI在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用的能力是非常合乎需要的。因此，為了在更廣泛的商業(yè)上相關(guān)的條件下生產(chǎn)生物燃料，本領(lǐng)域中對于具有增強(qiáng)的將木糖轉(zhuǎn)變成木酮糖的活性的XI酶，仍存在需求。

本公開涉及新的木糖異構(gòu)酶。所述木糖異構(gòu)酶具有木糖發(fā)酵所需的特性，例如高活性、對酸性條件(即低于7的pH水平，例如pH?6.5或pH?6)的耐受性或兩者。

本公開具有多個方面。一方面，本公開涉及XI多肽。本公開的多肽通常包含與表1的任何XI多肽或其催化結(jié)構(gòu)域或二聚化結(jié)構(gòu)域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或者由包含與表1的任何核酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、98％、99％或100％的序列同一性的核苷酸序列的核酸序列編碼：

在特定實(shí)施方式中，本公開的多肽包含：

(1)(a)與SEQ?ID?NO：78或其催化結(jié)構(gòu)域(SEQ?ID?NO：78的第2-377位氨基酸)具有至少97％或98％的序列同一性和/或(b)與SEQ?ID?NO：78或其催化結(jié)構(gòu)域(SEQ?ID?NO：78的第2-377位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并且還包含(i)SEQ?ID?NO：212或SEQ?ID?NO：213和/或(ii)SEQ?ID?NO：214；