[發明專利]通過使用流式細胞術的RNA測量快速檢測T細胞活化

在審

• 申請號: 201380045036.5
• 申請日: 2013-06-26
• 公開（公告）號: CN104662170A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: Y·布希金;M·L·真納羅;桑杰·泰爾吉;理查德·皮納
• 申請（專利權）人: 新澤西魯特格斯州立大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/04;G01N33/00
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;王芝艷

1.一種檢測至少一種表達于單個細胞中的RNA分子的拷貝的方法，其包括：

(a)提供包含細胞群的樣品，其中細胞表達能夠通過結合它們的配體或刺激分子來起始導致基因表達的信號級聯的特異性受體；

(b)通過將細胞與至少一種結合特異性受體并啟動基因表達的化合物孵育，在離體細胞中立即或培養后誘導基因表達；

(c)固定細胞并將細胞透性化；

(d)用一組熒光標記的寡核苷酸雜交探針標記至少一種由細胞表達的RNA分子的拷貝，并洗滌掉未結合的探針；和

(e)利用流式細胞術(FC)檢測具有表達事件的細胞，表達事件是通過熒光強度門控分類的一種或多種熒光測量。

2.如權利要求1所述的方法，其中誘導步驟包括利用存在于細胞群的抗原呈遞細胞(APC)或利用人工APC(aAPC)刺激T細胞受體(TCR)信號和下游基因表達。

3.如權利要求2所述的方法，其中經APC或aAPC誘導的刺激進行30分鐘至6小時。

4.如權利要求2所述的方法，其中誘導步驟包括與至少一種單克隆抗體(mAb)共刺激。

5.如權利要求2所述的方法，其中誘導步驟包括與至少一種結合aAPC的單克隆抗體(mAb)共刺激。

6.如權利要求1所述的方法。其中化合物源自微生物。

7.如權利要求1所述的方法，其中化合物包括肽或肽的混合物。

8.如權利要求2所述的方法，其中將與MHC?I類或MHC?II類分子相關的肽或肽的混合物添加到APC或aAPC。

9.如權利要求8所述的方法，其中肽或肽的混合物以1-20μg/ml之間的濃度存在。

10.如權利要求1所述的方法，其中至少一種RNA分子由細胞因子基因編碼。

11.如權利要求10所述的方法，其中基因編碼IL-2、TNFα或IFNγ。

12.如權利要求1所述的方法，其中刺激分子是結核分枝桿菌衍生的免疫原性肽。

13.如權利要求1所述的方法，其中探針組包括20-60個探針，其每個均用相同的熒光部分單獨標記。

14.如權利要求1所述的方法，其中細胞群是獲得自人類PBMC的T細胞，至少一種RNA分子由細胞因子基因編碼，細胞群中的細胞利用aAPC并用一種或多種與TCR相互作用的裝載肽的MHC分子誘導，并且探針組包括20-60個探針，其每個均用相同的熒光部分單獨標記。

15.如權利要求1所述的方法，其中具有表達事件的所檢測的細胞與不具有表達事件的細胞相分離。

16.如權利要求15所述的方法，其中分離的細胞僅包括一個細胞。

17.如權利要求15所述的方法，其中分離的細胞包括多于一個細胞。

18.如權利要求15所述的方法，其中利用熒光活化的細胞分選進行分離。

19.如權利要求15所述的方法，其中測量分離的細胞中的基因表達。

20.如權利要求19所述的方法，其中基因表達的測量利用RT-PCR或細胞中RNA的轉錄組分析來實現。

21.如權利要求1所述的方法，其中誘導步驟包括用微生物產物或合成化合物刺激toll樣受體信號和下游基因表達。

22.如權利要求21所述的方法，其中微生物產物是脂質、聚糖、糖脂、硫脂、糖蛋白、蛋白質、肽或核酸。

23.如權利要求21或22所述的方法，其中刺激進行30分鐘至6小時。

24.如權利要求2、21或22所述的方法，其中刺激進行6小時至24小時。

25.如權利要求2、21或22所述的方法，其中刺激進行24小時至72小時。

26.如權利要求21或22所述的方法，其中刺激物以1-100ng/ml之間的濃度存在。

27.如權利要求21或22所述的方法，其中刺激物以100-1000ng/ml之間的濃度存在。