[發明專利]用于自RNA模板開始的等溫DNA擴增試劑盒

有效

• 申請號: 201380044858.1
• 申請日: 2013-06-27
• 公開（公告）號: CN104583413B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: J.R.尼爾森;R.S.杜蒂;G.A.格羅斯曼;R.C.赫勒
• 申請（專利權）人: 通用電氣公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 黃登高;林森

提供了擴增RNA模板的方法。所述方法包括使用第一反應混合物，將核糖核酸(RNA)模板逆轉錄以形成cDNA，所述第一反應混合物包含RNA模板、能夠與RNA模板雜交的至少一種引物、逆轉錄酶和脫氧核苷三磷酸(dNTPs)；和使用第二反應混合物，擴增cDNA以形成擴增產物，所述第二反應混合物包含至少一種鏈置換DNA聚合酶、至少一種含肌苷的引物和能夠在引物的肌苷殘基的DNA 3'產生缺口的核酸酶。所述方法在等溫條件下完成，無需使cDNA模板變性。也提供了定量測定樣品中的RNA模板的方法和檢測樣品中的RNA模板的方法。也提供了用于自核糖核酸(RNA)模板擴增脫氧核酸(DNA)的試劑盒。

相關申請的交叉引用

本申請要求保護于2012年6月29日提交的美國專利申請號13/538,955和2012年6月29日提交的13/538,962的優先權，其公開內容通過引用全部結合到本文中。

發明領域

本發明總體涉及用于合成脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法通常在等溫條件下，自核糖核酸(RNA)模板開始在單次反應中通過使用逆轉錄酶、內切核酸酶和DNA聚合酶以擴增所需DNA。

發明背景

核酸擴增技術經常用于基于核酸的測定，其用于分析物檢測、傳感、法醫和診斷應用、基因組測序、全基因組擴增等。這些應用常常要求核酸擴增技術具有高特異性、靈敏度、準確性和穩健性。當起始核酸材料以少量存在時，核酸的擴增尤其重要。

目前許多技術用于擴增核酸，其中的一些僅從幾個分子的核酸材料開始擴增。這些技術包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCP)、自動維持序列復制(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)和滾環擴增(RCA)。目前有若干方法可用于將RNA逆轉錄為DNA，然后進行DNA擴增。將RNA逆轉錄為DNA的現有方法和隨后的DNA擴增包括兩個步驟并且是在不同條件下。

在聚合酶鏈式反應(PCR)中，將模板DNA、一對引物和DNA聚合酶混合在一起并進行重復溫度循環，其允許解鏈、退火和延伸步驟。解鏈或變性步驟典型地在高溫時發生，將聚合酶的選擇限制在嗜熱聚合酶并且其步驟可能進一步增加對儀器的需求。替代的擴增方法在等溫條件下使用鏈置換DNA聚合酶、含肌苷的引物和內切核酸酶V，從而消除了對實現核酸擴增的反應熱循環的需要和對熱穩定的聚合酶的需求；能夠經得起在高溫時重復加熱。內切核酸酶V，也稱為內切V或肌苷3′內切核酸酶，是一種DNA修復酶，該酶識別含有具有脫氨基的或經其它方式修飾的堿基例如肌苷的核苷酸的DNA。內切核酸酶V切割同一鏈中的肌苷3′的第二(或第三)磷酸二酯鍵，產生具有3′-羥基和5′-磷酸的缺口。在擴增反應中，DNA聚合酶以模板指導方式將核苷酸加到已有的DNA鏈的3'末端，導致5’→3’延伸，產生互補鏈。該延伸反應可包括已有鏈的置換，導致DNA鏈拷貝數的凈增加。

RNA模板的擴增在例如RNA表達譜分析中是需要的。在該技術中，測定生物樣品中的RNA分子的相對濃度。生物樣品中的一些RNA分子可能以相對低的濃度存在，因此在分析之前需要擴增RNA，以允許穩健的檢測和分析。經PCR的mRNA擴增導致以不同速率產生不同分子種類的RNA并可能提供模糊結果，使得難以進行RNA定量測定。另外，所述分析需要至少3個步驟和不同的條件。目前可用的RNA擴增技術具有高背景噪聲的問題，這可能是因非特異性擴增反應所致。

需要自RNA模板擴增DNA的更好的方法和組合物。理想地，這樣的方法和組合物應當更穩健、高度靈敏和可重復。

簡述

方法的一個實施方案包括使用第一反應混合物，將核糖核酸(RNA)模板逆轉錄以形成cDNA，所述第一反應混合物包含RNA模板、能夠與RNA模板雜交的至少一種引物、逆轉錄酶和脫氧核苷三磷酸(dNTPs)；和使用第二反應混合物，擴增cDNA以形成擴增產物，所述第二反應混合物包含至少一種鏈置換DNA聚合酶、至少一種含肌苷的引物和能夠在引物的肌苷殘基的DNA 3'產生缺口的核酸酶。所述方法在等溫條件下完成，無需使cDNA模板變性。