[發(fā)明專利]寡糖的大規(guī)模酶合成的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380044460.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN104822837B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁啟惠;吳宗益;蔡宗義
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中央研究院
• 主分類號(hào): C12P19/04
• 分類號(hào): C12P19/04;C12N9/10
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種以酶性方式合成寡糖的方法，其特征在于，包含：

(i)在UDP-Gal再生酶組的存在下，將半乳糖制成UDP-Gal，其中該UDP-Gal再生酶組包含半乳糖激酶、UDP-糖焦磷酸化酶及丙酮酸激酶；及

(ii)在UDP-Gal及α-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶存在下，將乳糖-OR^1A(Lac-OR^1A)轉(zhuǎn)換為Globo三糖-OR^1A(Gb3-OR^1A)，其中R^1A為氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烯基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的炔基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的環(huán)碳基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜環(huán)基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜芳基或氧保護(hù)基團(tuán)、生物素或神經(jīng)酰胺。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該UDP-Gal再生酶組包含焦磷酸化酶。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(i)及(ii)發(fā)生于Gb3-合成反應(yīng)混合物中，該Gb3-合成反應(yīng)混合物包括半乳糖、PEP、ATP、UTP、Lac-OR^1A、α-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶及UDP-Gal再生酶組。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在任何酶反應(yīng)發(fā)生前，Lac-OR^1A與半乳糖在Gb3-合成反應(yīng)混合物中的摩爾比為1：1。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該α-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶是來(lái)自腦膜炎雙球菌的LgtC，該半乳糖激酶是來(lái)自大腸桿菌，該UDP-糖焦磷酸化酶是來(lái)自擬南芥，該丙酮酸激酶是來(lái)自大腸桿菌，或該焦磷酸化酶是來(lái)自大腸桿菌。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含分離Gb3-OR^1A。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含：

(iii)在UDP-GalNAc及β-1,3-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶存在下，將Gb3-OR^1A轉(zhuǎn)換成Globo四糖-OR^1A(Gb4-OR^1A)。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含：

(iv)在UDP-GalNAc再生酶組存在下，將GalNAc制成UDP-GalNAc，其中該UDP-GalNAc再生酶組包含N-乙酰己糖胺1-激酶、N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶及丙酮酸激酶。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的UDP-GalNAc再生酶組還包含焦磷酸化酶。

10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，(iii)及(iv)在Gb-4合成反應(yīng)混合物中進(jìn)行，該Gb-4合成反應(yīng)混合物包含GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-OR^1A、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶及UDP-GalNAc再生酶組。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該Gb-4合成反應(yīng)混合物是通過(guò)將Gb-3合成反應(yīng)混合物至少與GalNAc、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶混合制得。

12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該β-1,3-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶是來(lái)自流感嗜血桿菌的LgtD，N-乙酰己糖胺1-激酶是來(lái)自龍根菌，N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶是來(lái)自大腸桿菌，該丙酮酸激酶是來(lái)自大腸桿菌，或該焦磷酸化酶是來(lái)自大腸桿菌。

13.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含分離Gb4-OR^1A。