[發明專利]用于非期望核酸序列的陰性選擇的組合物和方法

有效

• 申請號: 201380044292.2
• 申請日: 2013-03-15
• 公開（公告）號: CN104619894B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 克里斯多佛·阿穆爾;道格·阿莫萊賽;李斌;努里斯·庫恩
• 申請（專利權）人: 紐亙技術公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司11262
• 代理人: 李平,鄭霞

1.一種用于從核酸文庫中排除或減少特定的非期望的核酸序列的方法，該方法包括：

a.生成包含單鏈DNA片段的核酸文庫，該單鏈DNA片段在每個DNA片段的每個末端附接有固定取向的銜接子；

b.使序列特異性寡核苷酸探針與所述在每個末端附接有固定取向的銜接子的單鏈DNA片段退火，其中該序列特異性寡核苷酸探針被設計成與所述非期望的核酸序列互補，并且其中兩個銜接子中的至少一個包含對雙鏈DNA具特異性的限制性內切核酸酶的識別序列；

c.用DNA聚合酶延伸所述序列特異性寡核苷酸探針，從而生成包含所述非期望的核酸序列的至少一部分的雙鏈DNA片段；

d.用對雙鏈DNA具特異性的限制性內切核酸酶處理包含雙鏈和單鏈DNA的DNA片段群體，從而在限制性內切核酸酶位點處裂解雙鏈DNA片段；以及

e.用一組對所述銜接子序列具有特異性的引物進行PCR，從而擴增包含期望的核酸序列的DNA片段。

2.如權利要求1所述的方法，其進一步包括對擴增產物進行測序的額外步驟。

3.如權利要求1所述的方法，其中所述核酸文庫來源于分選的細胞的群體。

4.如權利要求3所述的方法，其中所述核酸文庫來源于單細胞。

5.如權利要求3所述的方法，其進一步包括將細胞分選到多孔板、微陣列、微流體裝置或載玻片中，由此產生分選的細胞的群體。

6.如權利要求5所述的方法，其中所述分選根據細胞表面標志物來進行。

7.如權利要求5所述的方法，其中所述分選根據細胞的光學性質來進行。

8.如權利要求5所述的方法，其中所述分選根據細胞大小來進行。

9.如權利要求1所述的方法，其中所述非期望的核酸序列包含細菌核糖體RNA、線粒體DNA、人珠蛋白mRNA、人細胞質rRNA、人線粒體rRNA、葡萄細胞質rRNA、葡萄線粒體rRNA或葡萄葉綠體rRNA。

10.如權利要求1所述的方法，其中步驟d.的限制性內切核酸酶是BspQI。

11.如權利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶包括熱啟動聚合酶。

12.如權利要求11所述的方法，其中所述DNA聚合酶是MyTaq聚合酶。

13.如權利要求1所述的方法，其中步驟a.包括以下步驟：

i.對RNA樣品進行逆轉錄；

ii.由逆轉錄的RNA樣品生成雙鏈cDNA，其中四種dNTP中的至少一種即dATP、dCTP、dGTP或dTTP在第二鏈合成過程中被非規范dNTP所替代，并摻入到第二鏈中；

iii.對雙鏈cDNA進行末端修復；

iv.將銜接子連接到所述雙鏈cDNA的5’端，其中銜接子鏈中的一條具有摻入到所述銜接子的連接鏈中的非規范核苷酸；

v.進行缺口修復；以及

vi.用裂解劑選擇性去除所述第二鏈。

14.如權利要求5所述的方法，其中所述非規范核苷酸包含尿苷或肌苷。

15.如權利要求13所述的方法，其中步驟vi包括裂解一種或多種非規范核苷酸的堿基部分，從而形成脫堿基位點。

16.如權利要求13所述的方法，其中所述裂解劑包含糖基化酶。

17.如權利要求16所述的方法，其中所述糖基化酶是UNG或UDG。

18.如權利要求13所述的方法，其中所述裂解劑包含伯胺。

19.如權利要求13所述的方法，其中所述裂解劑包含多胺。

20.如權利要求19所述的方法，其中所述多胺是DMED。

21.如權利要求13所述的方法，其中所述裂解劑包含糖基化酶和多胺。

22.如權利要求13所述的方法，其中所述裂解劑包含內切核酸酶V。