[發明專利]用于在絲狀真菌菌株中共沉默基因表達的方法及其應用

在審

• 申請號: 201380043346.3
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN104603269A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: H·布羅迪;E·里卡喬;寺本寬
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/80;C12P21/00
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種用于在絲狀真菌菌株中共沉默編碼生物物質的基因的表達的方法，包括：

(a)向該絲狀真菌菌株的基因組中插入一個雙鏈可轉錄核酸構建體，該構建體包括一個可操作地連接至一個第一多核苷酸的啟動子，該第一多核苷酸包括一個與編碼第一生物物質的第一靶基因具有同源性的第一可轉錄區，一個第二多核苷酸，該第二多核苷酸包括一個與編碼第二生物物質的第二靶基因具有同源性的第二可轉錄區，以及一個第三多核苷酸，該第三多核苷酸包括一個與該第一和第二靶基因無有效同源性的第三可轉錄區；其中該第三可轉錄區包括兩個在相反方向上彼此互補的區段；并且其中該第一、第二和第三可轉錄區被轉錄為一個單鏈RNA分子；并且

(b)通過以下產生短干擾RNA(siRNA)：將該絲狀真菌菌株在一定條件下培養，以產生該雙鏈可轉錄核酸構建體的RNA轉錄本，這些RNA轉錄本然后被轉化為siRNA，這些siRNA與這些靶基因的RNA轉錄本相互作用，以沉默編碼該第一和第二生物物質的靶基因的表達。

2.如權利要求1所述的方法，其中該第三可轉錄區與一個第三靶基因具有同源性。

3.如權利要求1或2所述的方法，其中這些靶基因的每一個的表達都被減少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。

4.一種絲狀真菌菌株，該絲狀真菌菌株包括一個雙鏈可轉錄核酸構建體，該構建體包括一個可操作地連接至一個第一多核苷酸的啟動子，該第一多核苷酸包括一個與編碼第一生物物質的第一靶基因具有同源性的第一可轉錄區，一個第二多核苷酸，該第二多核苷酸包括一個與編碼第二生物物質的第二靶基因具有同源性的第二可轉錄區，以及一個第三多核苷酸，該第三多核苷酸包括一個與該第一和第二靶基因無有效同源性的第三可轉錄區；其中該第三可轉錄區包括兩個在相反方向上彼此互補的區段；其中該第一、第二和第三可轉錄區被轉錄為一個單鏈RNA分子；并且其中通過以下產生短干擾RNA(siRNA)：將該絲狀真菌菌株在一定條件下培養，以產生該雙鏈可轉錄核酸構建體的RNA轉錄本，這些RNA轉錄本然后被轉化為siRNA，這些siRNA與這些靶基因的RNA轉錄本相互作用，以沉默編碼該第一和第二生物物質的靶基因的表達。

5.如權利要求4所述的絲狀真菌菌株，其中該第三可轉錄區與一個第三靶基因具有同源性。

6.如權利要求4或5所述的絲狀真菌菌株，其中這些靶基因的每一個的表達都被減少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。

7.一種用于產生感興趣的生物物質的方法，包括在有助于產生該感興趣的生物物質的條件下培養一種絲狀真菌菌株，其中該絲狀真菌菌株包括一個雙鏈可轉錄核酸構建體，該構建體包括一個可操作地連接至一個第一多核苷酸的啟動子，該第一多核苷酸包括一個與編碼第一生物物質的第一靶基因具有同源性的第一可轉錄區，一個第二多核苷酸，該第二多核苷酸包括一個與編碼第二生物物質的第二靶基因具有同源性的第二可轉錄區，以及一個第三多核苷酸，該第三多核苷酸包括一個與該第一和第二靶基因無有效同源性的第三可轉錄區；其中該第三可轉錄區包括兩個在相反方向上彼此互補的區段；其中該第一、第二和第三可轉錄區被轉錄為一個單鏈RNA分子；其中通過以下產生短干擾RNA(siRNA)：將該絲狀真菌菌株在一定條件下培養，以產生該雙鏈可轉錄核酸構建體的RNA轉錄本，這些RNA轉錄本然后被轉化為包括有待被沉默的靶基因的序列的siRNA，這些siRNA與這些靶基因的RNA轉錄本相互作用，以沉默編碼該第一和第二生物物質的靶基因的表達；并且其中該絲狀真菌菌株包括一個編碼該感興趣的生物物質的第四多核苷酸。

8.如權利要求7所述的方法，進一步包括從培養基中回收該感興趣的生物物質。

9.如權利要求7或8所述的方法，其中該第三可轉錄區與一個第三靶基因具有同源性。

10.如權利要求7-9中任一項所述的方法，其中這些靶基因的每一個的表達都被減少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。