[發(fā)明專利]環(huán)節(jié)動物血紅蛋白冷凍干燥法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380041489.0
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN104519901A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: F·察爾;M·魯斯洛
• 申請（專利權(quán)）人: 埃瑪里納
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61K9/19
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所11256
• 代理人: 孟凡宏;金惠淑

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及環(huán)節(jié)動物的至少一種細胞外血紅蛋白、珠蛋白原聚體或珠蛋白的冷凍干燥方法，以及所獲得的凍干物。

背景技術(shù)

環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白作為血液代用品，可能治療與缺氧相關(guān)的問題。

術(shù)語“血液代用品”的意思是指可以通過提供氧載體來補償出血后失血的任意產(chǎn)品或溶液。血液代用品不同于人造血，因為血液代用品不能完成血液提供的所有功能，例如激素運輸。

目前，已知兩種藥物類的替代品：它們是全氟化碳(PFCs)和血紅蛋白氧載體(HBOC)。

PFC是允許O₂以溶解在血液中的形式運輸至組織的化學(xué)合成化合物。

HBOC來自于牛HB或人HB(后者來自過期的血袋)的純化后化學(xué)修飾，或通過基因工程合成得到。

為儲存HBOC，傳統(tǒng)的方法是在溶液中調(diào)節(jié)血紅蛋白分子。為保證更好的穩(wěn)定性，在某些情況下，需要在使用前將其儲存于-20℃和-80℃之間。然后用干冰運輸以確保其不會解凍。這些各種條件涉及額外的成本和更嚴格的儲存和運輸物流，證明其對于某些應(yīng)用是有限制性的。

因此，需要一種包括在沒有致冷條件的遠程環(huán)境下容易儲存和運輸?shù)墓δ苄匝t蛋白。

一種解決的辦法是冷凍干燥法。

然而，初步研究表明血紅蛋白分子在冷凍干燥過程中部分降解，因此特別地損害其功能性，即其可逆地結(jié)合氧的能力。此外，這在蛋白質(zhì)文獻中也有總體描述(Heller?Martin.C,Carpenter?John.F,Randolph?Theodore.W,“Protein?Formulation?and?Lyophilization?Cycle?Design:Prevention?of?Damage?due?to?Freeze-Concentration?Induced?Phase?Separation”Biotechnology?and?Bioengineering,Vol?63,No.2,1999)。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，令人驚訝的是，環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白，當(dāng)與特定的穩(wěn)定劑混合時，能被凍干的同時保持其四級結(jié)構(gòu)、其功能性以及其功效。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明涉及環(huán)節(jié)動物的至少一種細胞外血紅蛋白、珠蛋白原聚體或珠蛋白的冷凍干燥方法。本發(fā)明還涉及所獲得的凍干物。事實上后者可以將環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白、其珠蛋白及其珠蛋白原聚體以經(jīng)濟實用(例如，需要最小的空間)的形式儲存，并同時保持該血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。

本發(fā)明的凍干物包含環(huán)節(jié)動物的至少一種細胞外血紅蛋白、珠蛋白原聚體或珠蛋白，和選自雙糖、多元醇和抗氧化劑的穩(wěn)定劑。

本發(fā)明還涉及一種組合物，其包含：

-含有環(huán)節(jié)動物的至少一種細胞外血紅蛋白、珠蛋白原聚體或珠蛋白的溶液，和

-選自雙糖、多元醇和抗氧化劑的穩(wěn)定劑，優(yōu)選地選自海藻糖和抗壞血酸。

環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白在三類環(huán)節(jié)動物中存在：多毛綱、寡毛綱和無毛綱。提及細胞外血紅蛋白是因為其不是天然地包含在細胞中，且因此可以在血流中自由循環(huán)，而不需化學(xué)修飾以使其穩(wěn)定或使其起作用。

環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白是分子量為2000至4000kDa的巨大生物聚合物，其由一般分為兩個類別的4至12種不同類型的大約200個多肽鏈組成。

第一類有144至192個組分，組合成為帶有血紅素類型活性位點且能可逆地結(jié)合氧的“功能性”多肽鏈；這些是珠蛋白類型的鏈，其重量為15至18kDa，且其與脊椎動物的α-和β-型鏈非常相似。

第二類有36至42個組分，組合成為具有很少或沒有活性位點但能夠使亞單元組裝在一起的“結(jié)構(gòu)性”或“接頭”多肽鏈，所述亞單元稱為十二分之一亞單元或原聚體。

每個血紅蛋白分子由兩個疊加的六角形構(gòu)成，其被稱為六角形雙層且每個六角形本身由水滴形式的六個亞單元組裝形成(或“十二分之一亞單元”或“原聚體”)。該天然分子由十二個這些亞單元(十二具體或原聚體)構(gòu)成。每個亞單元的分子量在200和250kDa之間，并構(gòu)成該原始分子的功能性單元。

優(yōu)選地，環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白選自多毛綱環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白，優(yōu)選沙蠋科(Arenicolidae)的細胞外血紅蛋白和沙蠶科(Nereididae)的細胞外血紅蛋白。甚至更優(yōu)選地，所述環(huán)節(jié)動物的細胞外血紅蛋白選自海沙蠋(Arenicola?marina)的細胞外血紅蛋白和沙蠶屬(Nereis)的細胞外血紅蛋白，更優(yōu)選海沙蠋的細胞外血紅蛋白。