[發(fā)明專利]在培養(yǎng)基上分離微生物的方法及相關(guān)裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380038691.8
• 申請日: 2013-07-22
• 公開（公告）號: CN104487563B
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J-P·弗朗德魯瓦;B·利蒙;C·羅藏;M-P·蒙泰
• 申請（專利權(quán)）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: C12M1/26
• 分類號: C12M1/26;C12Q1/24
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司72002
• 代理人: 左路

本發(fā)明一般地涉及微生物學(xué)分析領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及分離至少一種得自污染樣品的微生物的方法。

從待分析樣品或微生物懸液開始在凝膠培養(yǎng)基上分離微生物通常是許多微生物學(xué)分析方法中不可或缺的步驟。這個步驟尤其用于進行鑒定、驗證樣品的微生物純度或者通過計數(shù)由此獲得的分離的菌落進行細菌計數(shù)。

分離技術(shù)的目的是在凝膠營養(yǎng)培養(yǎng)基上獲得可以直接使用的菌落(CDU)，用于鑒定及確定對抗生素的敏感性。它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，劃線技術(shù)是參考技術(shù)。后者包括通過以相等的每單位經(jīng)過面積概率在表面上劃線而沉積接種物。在工具經(jīng)過時，分布的局部密度大約指數(shù)性降低。因此，從單一接種物制備一些涂布帶，所述帶之間有或沒有重疊，以獲得合適的分布效果及在下一個涂布區(qū)段細菌的稀釋。在涂布結(jié)束時，細胞彼此充分分離，由此以CDU形式生長的微生物(可見的菌落或微菌落)沒有迭生，即使是部分迭生。這種技術(shù)也可以通過旋轉(zhuǎn)平板單一連續(xù)螺旋接種而進行，或者通過由裝置驅(qū)動的磁珠進行，產(chǎn)生不重疊或者任選地部分重疊的連續(xù)接種。

另一種廣泛使用的技術(shù)包括通過在表面上涂布而在一皿膠化的培養(yǎng)基上分離。在這種情況中，將低細胞密度的細胞混合物涂布在直徑9cm的培養(yǎng)皿中的凝膠表面上，所述混合物使得可以對30-300個細胞進行培養(yǎng)，每個細胞生長成分離的菌落。當(dāng)少于30個細胞與營養(yǎng)凝膠接觸時，統(tǒng)計學(xué)問題影響計數(shù)準(zhǔn)確度。

當(dāng)計數(shù)的數(shù)量超過300個細胞時，由于菌落表面的重疊產(chǎn)生計數(shù)誤差。涂布通常通過一種包括例如與凝膠接觸的線性部分的工具實現(xiàn)，或者使用以無序運動在表面上隨機滾動的直徑為幾毫米的珠實現(xiàn)。這種技術(shù)僅適合輕微污染或者稀釋的樣品，因為由于生長，高細胞數(shù)增加菌落的匯合概率。

還可以在培養(yǎng)皿上通過深度接種進行分離。初始樣品稀釋若干次以充分降低微生物群體數(shù)量及獲得分離的菌落。然后將小體積的每種稀釋樣品與液體凝膠混合，通常是過度冷卻到大約45℃的瓊脂。立即將混合物倒入培養(yǎng)皿中，膠凝及溫育后，每個細胞被固定并形成菌落。

由于裝置的發(fā)展一些手工方法已自動化。例如在文獻EP-0 242 114的情況中就是如此，其描述了用于用樣品接種培養(yǎng)基的設(shè)備和方法。所述方法包括從一個接種物進行若干區(qū)段涂布。這些區(qū)段呈圓弧形并且通過4個不同涂布頭進行。通過后續(xù)區(qū)段的部分重疊獲得樣品稀釋的效果。該文獻中描述的方法事實上非常類似于手工分離的參考方法。

最近，已開發(fā)了新分離方法，通過使用如文獻WO-A-2005071055中描述的優(yōu)化的涂布器而改良細菌耗盡(épuisement)。這尤其適用于申請人以P REVITM Isola出售的自動化裝置中采用的接種方法。

但是，這些分離技術(shù)僅在凝膠培養(yǎng)基上有效。

在臨床診斷和食品工業(yè)微生物控制領(lǐng)域、藥品或化妝品工業(yè)領(lǐng)域，自19世紀(jì)末開始，在培養(yǎng)皿中的凝膠培養(yǎng)基(最經(jīng)常是瓊脂)構(gòu)成了檢測和鑒定病原體微生物的不可或缺的工具。

但是，已開發(fā)了非常多的替代培養(yǎng)皿的產(chǎn)品。對于這些產(chǎn)品，再水化在原位進行，即直接在用于接種和用于溫育的空間中。其中之一，包含可再水化營養(yǎng)素的petrifilm^TM系統(tǒng)，被非常廣泛地使用。Nissui Pharmaceutical公司開發(fā)的另一種系統(tǒng)Compact Dry也包括脫水培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基的優(yōu)點是它們比即用瓊脂培養(yǎng)基保存更長時間。像petrifilm^TM，它們也可以非常緊湊，因此使用的溫育空間小。可用于培養(yǎng)的表面有限，每細胞可利用的營養(yǎng)素濃度適合產(chǎn)生比在傳統(tǒng)凝膠培養(yǎng)基上產(chǎn)生的直徑小的菌落，并且由于所用凝膠的低硬度或者細菌的高擴散系數(shù)而導(dǎo)致菌落形態(tài)也可以被改變。

無論如何，只能通過在再水化期間形成的凝膠在這些培養(yǎng)基上分離菌落，并且因此從具有低污染水平或者經(jīng)歷一系列稀釋的初始樣品分離。要沉積在培養(yǎng)基上的終濃度必須是300CFU/ml以下(CFU：菌落形成單位)，這些常規(guī)數(shù)據(jù)取決于菌落大小。

另外，這些培養(yǎng)基不能禁得起耗盡分離工具的機械應(yīng)力而不受磨損。因此，這些可以直接原位(即在用于接種和保溫的空間)再水化的培養(yǎng)基的主要問題之一是它們與手工或自動化機械分離微生物不相容。當(dāng)初始樣品被重污染時(超過300CFU/ml)，它們需要進行一系列稀釋，這意味著取更大樣品，浪費時間及消耗大量試劑(培養(yǎng)基、稀釋劑試管等)、產(chǎn)生大體積廢物(高壓滅菌、處理成本)。另外，如果進行大量稀釋，有通過稀釋作用丟失靶病原體微生物的風(fēng)險，如果所述靶病原體微生物相對于總微生物群以少量存在。