[發(fā)明專利]用于檢測微小殘留病的方法、試劑以及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380037624.4
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN104471393B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雅各布斯·約翰內(nèi)斯·瑪麗亞·萬東恩;何塞·阿爾貝托·奧爾方德馬托斯克瑞亞埃韋爾;朱安·亞歷杭德羅·弗洛雷斯蒙特羅;茱莉亞·瑪麗亞·阿爾梅達(dá)帕拉;文森特·亨利庫斯·約翰內(nèi)斯·萬德費(fèi)爾登;塞巴斯蒂安·博埃特赫爾;朗托尼·威廉·朗格拉克;埃斯特爾·邁斯特日科娃;托馬斯·什切潘斯基;馬蒂亞斯·里特根;保羅·約根·蒙泰羅達(dá)席爾瓦盧西奧
• 申請（專利權(quán)）人: 鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)療中心
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/574
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11227
• 代理人: 鄭斌,彭鯤鵬

本發(fā)明涉及癌癥診斷領(lǐng)域，更特別地涉及用于在治療期間和治療后監(jiān)測疾病發(fā)展或者用于檢測微小播散性疾病的手段和方法。抑制細(xì)胞治療或細(xì)胞毒劑治療誘導(dǎo)大多數(shù)患有淋巴樣惡性腫瘤患者中的緩解。然而，這些患者中的許多都會復(fù)發(fā)。顯然，雖然根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)它們達(dá)到了所謂的完全緩解，但是現(xiàn)有的抑制細(xì)胞治療或細(xì)胞毒劑治療方案不能殺傷這些復(fù)發(fā)患者中的所有惡性細(xì)胞。因為細(xì)胞形態(tài)學(xué)技術(shù)的檢出限不低于1％至5％惡性細(xì)胞，所以顯然該技術(shù)僅可提供關(guān)于治療效力的表面信息，仍有多達(dá)10¹⁰的腫瘤細(xì)胞潛在地留在體內(nèi)。

需要靈敏度更高的技術(shù)來檢測“微小殘留病(minimal residual disease)”或微小疾病(MRD)以獲得對誘導(dǎo)治療期間腫瘤塊的減少以及維持治療期間從一種或多于一種組織中進(jìn)一步根除惡性細(xì)胞的更好理解。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MRD通常基于經(jīng)由與惡性腫瘤相關(guān)的表型特征來區(qū)別惡性細(xì)胞與正常白細(xì)胞，例如抗原的異常表達(dá)、過表達(dá)和跨系表達(dá)。

現(xiàn)有的4色和6色流式細(xì)胞術(shù)在多數(shù)患有血液惡性腫瘤(hematological malignancy)的患者中達(dá)到了10^-3(至10^-4)的良好靈敏度。然而，應(yīng)注意在治療期間和治療后以及在造血干細(xì)胞移植后，高頻正常再生細(xì)胞可妨礙血液、骨髓和其他體液(例如腦脊髓液)中低頻惡性細(xì)胞的檢測。每種治療方案、每個治療階段、每段取樣時間的再生的程度和模式存在差異，并且似乎取決于先前治療的強(qiáng)度：治療的強(qiáng)度越大，造血細(xì)胞的再生越顯著。

邏輯上，再生細(xì)胞的背景和藥物誘導(dǎo)的免疫表型偏移兩者均降低了現(xiàn)有4色和6色流式細(xì)胞術(shù)MRD方法的靈敏性和特異性。這主要導(dǎo)致了以下方法：其中使用多種標(biāo)志物的組合來評價患者的MRD或者另外使用一種或數(shù)種患者特異性的標(biāo)志物組合。認(rèn)識到需要改進(jìn)MRD的診斷方法，本發(fā)明人著手于鑒定可用來獲得用于檢測MRD的更靈敏和更可靠測定的另外的標(biāo)志物，特別地基于其中經(jīng)由多變量分析來組合多個標(biāo)志物信息的完全整合方法。此外，該新方法不再限于個別患者，而是適用于特定疾病類別的每個患者，例如B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病(B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL)和多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)。

在仔細(xì)地選擇相關(guān)標(biāo)志物后，設(shè)計多色管中抗體的適當(dāng)組合并且選擇合適的熒光染料(基于對亮度、補(bǔ)償、穩(wěn)定性等的需要)來開發(fā)抗體試劑集(set)。為了重塑(reshape)并實現(xiàn)最佳功效，采用共有組(consensus panel)的廣泛多中心評價(extensive multicentric evaluation)對研究進(jìn)行補(bǔ)充。本發(fā)明人仔細(xì)地選擇并且徹底地測試抗體組合，設(shè)計了可達(dá)到10^-4至10^-5靈敏度的新的≥8色染色。基于設(shè)計-測試-再設(shè)計-再測試-再設(shè)計(等)，已經(jīng)開發(fā)了針對每種疾病類別(例如BCP-ALL、B-CLL和MM)之熒光染料綴合抗體的特異性組合。每位患者的一種或兩種≥8色組合將允許以至少10^-4的靈敏度仔細(xì)地進(jìn)行MRD監(jiān)測。所提供的10色和12色抗體組合甚至可更好地區(qū)別正常細(xì)胞和其惡性對應(yīng)物，由此使得MRD檢測的靈敏度能夠低至10^-5。

我們在此提供了新的8色、10色和12色抗體組合，其用于檢測從患有以下疾病的患者所分離樣品(例如，血液或骨髓)中的MRD：

-B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病(BCP-ALL)

-B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)或者

-多發(fā)性骨髓瘤(MM)和相關(guān)的漿細(xì)胞病(plasma cell disorder，PCD)。

這些多色免疫染色可根據(jù)如Van Dongen等Leukemia 2012；26：1908-1075和由Kalina等Leukemia 2012；26：1986-2010所述的所謂的EuroFlow方案進(jìn)行。