[發明專利]表達和分泌系統

有效

• 申請號: 201380035629.3
• 申請日: 2013-07-03
• 公開（公告）號: CN104428416B
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: D·特薩;X·陳;M·丹尼斯;I·霍特策爾
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/76;C12N15/64
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

本發明提供了表達和分泌系統，以及使用它們的方法，用于在原核細胞中表達和分泌一種融合蛋白質并且在真核細胞中表達和分泌第二種融合蛋白質。在本文中還提供了核酸分子、載體以及包含此類載體和核酸分子的宿主細胞。

相關申請的交互引用

本申請要求2012年7月5日提交的美國臨時申請號61/668397、2013年3月15日提交的61/852483和2013年5月3日提交的61/819063的優先權的權益，所述全部專利申請在本文中以其整體引入作為參考。

發明領域

本發明涉及表達和分泌系統及其使用的方法，用于當核酸轉化到用于噬菌體展示的原核細胞時表達和分泌一種Fab融合蛋白質，并當核酸轉染到用于表達和純化的真核細胞時表達和分泌不同的或者相同的Fab融合蛋白質。在本文中還提供了核酸分子、載體以及包含此類載體和核酸分子的宿主細胞。

發明背景

多肽或蛋白質在絲狀噬菌體顆粒上的噬菌體展示是允許從多種肽或蛋白質的大型庫中挑選具有期望特性的肽或蛋白質的體外技術(McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Sidhu等人,CurrentOpinion in Biotechnology,11:610-616(2000)；Smith等人,Science,228:1315-1317(1985))。可將噬菌體展示用于在絲狀噬菌體顆粒的表面展示肽或蛋白質(包括抗體片段如抗體研發領域的Fab)的不同文庫，然后挑選與特定的目的抗原結合的。可以通過將抗體片段的基因與噬菌體外殼蛋白的基因融合，將抗體片段展示在絲狀噬菌體顆粒的表面上，產生在其表面展示編碼的抗體片段的噬菌體顆粒。該技術允許從大型噬菌體文庫中分離與多種抗原具有期望親和力的抗體片段。

對于基于噬菌體的抗體研發，在功能測定法(例如目標結合、基于細胞的活性測定、體內半衰期等)中評價挑選的抗體片段及其同源IgG的特性需要通過從用于噬菌體展示的載體中分離編碼HC和LC的DNA序列，并亞克隆到用于IgG表達的哺乳動物表達載體中，來將Fab重鏈(HC)和輕鏈(LC)序列重新格式化成全長IgG。亞克隆數十或數百個挑選的HC/LC對的費力方法代表了基于噬菌體的抗體研發方法的主要瓶頸。此外，一旦重新格式化，由于在最初的篩選測定中相當比例挑選的Fab沒有令人滿意地施行，那么增加進行該重新格式化/篩選方法的克隆的數目將極大地增加成功的最終可能性。

在本文中，我們描述了表達和分泌系統的產生，用于當轉化到大腸桿菌中時驅動Fab-噬菌體融合的表達，并當轉染到哺乳動物細胞中時驅動包含相同Fab片段的全長IgG的表達。我們證明，來自鼠結合免疫球蛋白(mBiP)的哺乳動物信號序列(Haas等人,Immunoglobulin heavy chain binding protein,Nature,306:387-389(1983)；Munro等人,An Hsp70-like protein in the ER:identify with the 78kd glucose-regulatedprotein and immunoglobulin heavy chain binding protein,Cell,4:291-300(1986))可以在原核和真核細胞二者中驅動有效的蛋白質表達。使用哺乳動物mRNA剪接，去除在人IgG₁HC的鉸鏈區內插入的含噬菌體融合肽的合成的內含子，我們可以以宿主細胞依賴性方式產生兩種不同的蛋白質：用于在大腸桿菌中噬菌體展示的與接頭肽融合的Fab片段和哺乳動物細胞中的天然人IgG₁。該技術允許挑選與來自噬菌體展示文庫的目的抗原結合的Fab片段，并且可以在不需要亞克隆的情況下，在哺乳動物細胞中后續表達同源全長IgG并純化。

發明概述