[發明專利]生產具有可控分子量的高純度透明質酸鈉(HANA)的方法

有效

• 申請號: 201380035588.8
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN104662158B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: M·帕柳卡;A·魯杰羅;F·沃爾佩
• 申請（專利權）人: 阿爾特剛意大利有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 陳迎春,黃革生

說明書摘要

公開的是用于生產透明質酸鈉(HANa)的方法，其包括在合適的條件下，在含有糖作為碳源的營養培養基中培養馬鏈球菌屬(Streptococcus equi)獸疫(zooepidemicus)亞種的微生物。

本發明涉及通過鏈球菌屬(Streptococcus)的微生物的大規模發酵來生產高度純化的透明質酸鈉鹽的方法。

發明領域

本發明涉及用于生產高度純化的透明質酸鈉的方法，并特別涉及包括發酵步驟的方法。

通過本發明的方法，按照當前的純度、安全性和一致性標準生產HANa。為了獲得高的純度，在方法中使用不含有動物來源成分的培養基。

由于其顆粒的多孔性和小的尺寸，通過本文要求保護的方法獲得的HANa比動物和發酵來源的其他HANa溶解地更快，導致制造時間和成本的極大降低。此外，材料的高純度使得其能夠隨后被滅菌，而分子量沒有任何明顯丟失。這種新的制造方法的優勢因而是絕對的安全性、高純度譜和低熱不穩定性；快速的容散性和簡單的過濾性以制備溶液；和分子量的重復性，其與低多分散性(polydispersity)相關。

現有技術

透明質酸是自然界中存在的糖胺聚糖，其由具有50,000-13,000,000道爾頓分子量的線性聚合物組成。其是通過交替的β1-3和β1-4鍵鍵合的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的重復單元形成的多糖。透明質酸存在于動物的多種結締組織中，如皮膚和軟骨。一些器官，如臍帶、滑膜液、玻璃體液和公雞冠中特別富含透明質酸。透明質酸還由多種微生物，如類型A和C的鏈球菌產生。透明質酸存在于所有的身體組織中，并執行許多重要的功能。其促進營養物的釋放并從沒有血液供應的細胞，如定位在軟骨中的那些細胞中轉運毒素；沒有足量的HA的話，關節會惡化并且變脆。透明質酸不僅保持關節潤滑，還刺激其他身體組織中的液體潴留。在皮膚和軟骨中，透明質酸的作用是結合水并保持組織的張力和彈性。關節液中的粘性透明質酸溶液充當潤滑劑，為細胞提供保護環境。

由于其親水的性質及其流變學和潤滑的性質，透明質酸鈉是具有高增值的生物聚合物，其具有廣泛的醫學應用，包括皮膚水合、骨關節炎治療、眼科手術、在腹部外科手術后防止粘連，和創傷愈合。

透明質酸鈉的新用途是基于其修改細胞行為能力的藥物釋放、包被/移植和治療處理。因為在許多所述應用中配制的產物的性能依賴于生物聚合物的分子量，所以MW代表透明質酸鈉生產中頭等重要性的特征。

具有兩種獲得透明質酸鈉的主要方法：(i)從動物組織中提取透明質酸(例如從公雞冠中提取)；(ii)培養微生物并回收作為發酵產物的透明質酸。

(i)從公雞冠中提取昂貴且耗時，并且導致嚴重的問題，即由于降解透明質酸的酶(HAase)的污染而導致質量下降，和注射時的炎癥反應。提取方法的特征還在于許多問題和低產量、初始材料的受限可用性、不能控制終產物的特征(如分子量)，和來自病毒的污染風險。

(ii)通過發酵合適的微生物生產透明質酸鈉在成本方面代表有效的方法。在文獻中描述了許多方法使用發酵技術生產和純化透明質酸鈉。然而，它們中的許多方法通常使用季銨鹽來去除雜質，導致漫長的沉淀再溶解時間并且在終產物中存在季銨鹽。此外，所述純化技術主要基于不同的沉淀步驟，其需要廣泛使用有機溶劑，因此增加了純化產物和處理廢物相關的成本。

US2010/0137579A1公開了用于純化生物來源(獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus))的透明質酸的方法，其適合用于醫學使用，包括滲濾和超濾步驟。

出版物Biopolymers,2010,387-412描述了這樣的方法，其用于通過發酵Streptococcus zooepidermicus，通過碳濾池過濾、超濾/滲濾和通過微量過濾滅菌來生物技術生產透明質酸。

Separation and Purification Technology,2006,52,29-38描述了兩步切向流過濾方法，其用于從發酵液中分離透明質酸。然而，該方法不適合于大規模生產透明質酸，并且后者不能達到適合于醫學使用的純度。

在所述方法相關的問題上，簡單、容易應用并且能夠去除雜質如蛋白質、核酸、內毒素、金屬離子等的透明質酸鈉制造方法的重要性是清晰的。

發明描述

本發明涉及高產量生產透明質酸鈉的方法，該方法通過在好氧條件下，在富含氣流的生長培養基中發酵鏈球菌細菌，隨后從所得培養液中分離細菌，并從該培養液中分離透明質酸鈉。