[發(fā)明專利]獲得肽的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380035027.8
• 申請日: 2013-05-02
• 公開（公告）號: CN104540941A8
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 瑪麗-海琳·查爾斯;J-P·沙里耶;瑪麗亞姆-勞瑞·庫比左勒斯;阿涅斯·杜邦-菲力阿德;韋羅妮克·拉內(nèi);弗洛倫斯·里韋拉;勞倫特·韋龍
• 申請（專利權(quán)）人: 生物梅里埃公司;原子能與替代能源委員會
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C07K1/12;C12Q1/34;G01N33/68
• 代理公司: 北京安信方達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 王思琪;鄭霞

1.一種從原核細胞和/或真核細胞獲得肽的方法，所述方法包括以下步驟：

a)裂解原核細胞和/或真核細胞并且回收由此獲得的蛋白質(zhì)，

b)使用至少一種變性劑使所述蛋白質(zhì)變性，

c)使用至少一種烷基化劑使變性的蛋白質(zhì)烷基化，

d)使用至少一種蛋白水解酶將在步驟c)結(jié)束時獲得的蛋白質(zhì)酶促蛋白水解，

e)回收在酶促蛋白水解步驟d)結(jié)束時獲得的肽，

其中步驟a)中所述原核細胞和/或真核細胞的裂解是在低濃度離液劑下的裂解。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述在低濃度離液劑下的裂解在小于或等于1M、優(yōu)選地小于或等于100mM的離液劑濃度下進行。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述在低濃度離液劑下的裂解在不存在非鹽離液劑比如尿素時進行。

4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中的一項所述的方法，其中所述在低濃度離液劑下的裂解是通過借助于超聲波探頭進行的聲處理的裂解。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述超聲波探頭在通過聲處理裂解之前不經(jīng)受預(yù)熱步驟。

6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中的一項所述的方法，其中所述蛋白水解酶是絲氨酸蛋白酶，其優(yōu)選地選自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶組成的組，有利地，所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中的一項所述的方法，其中所述變性劑是硫醇還原劑，其優(yōu)選地選自2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫赤蘚糖醇、三丁基膦和二硫蘇糖醇，有利地，所述硫醇還原劑是三(2-羧乙基)膦或二硫蘇糖醇。

8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中的一項所述的方法，其中所述烷基化劑選自由N-乙基馬來酰亞胺、碘乙酰胺和M-生物素形成的組，優(yōu)選地，所述烷基化劑是碘乙酰胺。

9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中的一項所述的方法，其中對應(yīng)于所述蛋白水解步驟d)的最小持續(xù)時間為大約15分鐘。

10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中的一項所述的方法，其中至少步驟a)和步驟b)相連地進行。

11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中的一項所述的方法，其中至少步驟a)-步驟c)相連地進行。

12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中的一項所述的方法，其中至少步驟a)-步驟d)相連地進行。

13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中：

-所述變性劑是硫醇還原劑，其選自三(2-羧乙基)膦和二硫蘇糖醇硫醇還原劑，有利地，所述硫醇還原劑是三(2-羧乙基)膦，并且

-所述烷基化劑是碘乙酰胺。

14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中的一項所述的方法，所述方法在低于100巴、優(yōu)選地小于50巴、有利地小于10巴的壓力之下進行。

15.根據(jù)權(quán)利要求1到14的一項所述的方法，所述方法在大氣壓力下進行。

16.一種分析原核細胞和/或真核細胞的肽的方法，所述方法包括以下步驟：

i)使用根據(jù)權(quán)利要求1到15中的一項所述的方法從所述原核細胞和/或真核細胞獲得肽，

ii)分析由此獲得的所述肽，所述分析使用質(zhì)譜類型的分析方法進行。

17.用于從原核細胞和/或真核細胞獲得肽的試劑盒，所述試劑盒特別適于進行根據(jù)權(quán)利要求1到15中的一項所述的方法，所述試劑盒包括：

-裂解試劑盒，其允許在低濃度離液劑下來進行原核細胞和/或真核細胞的裂解，優(yōu)選地為用于通過聲處理裂解的試劑盒，

-第一溶液，其包括至少一種變性劑，所述變性劑優(yōu)選地選自2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫赤蘚糖醇、三丁基膦和二硫蘇糖醇，有利地，所述變性劑是三(2-羧乙基)膦或二硫蘇糖醇，

-第二溶液，其包括至少一種烷基化劑，所述烷基化劑優(yōu)選地選自任何N-乙基馬來酰亞胺、碘乙酰胺和M-生物素形成的組，優(yōu)選地，所述烷基化劑是碘乙酰胺，

-第三溶液，其包括至少一種蛋白水解酶，比如絲氨酸蛋白酶，所述蛋白水解酶優(yōu)選地選自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶組成的組，有利地，所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。

18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒用于進行根據(jù)權(quán)利要求1到16中的一項所述的方法的用途。