[發(fā)明專利]減少糖蛋白聚集的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380034684.0
• 申請(qǐng)日: 2013-06-27
• 公開（公告）號(hào): CN104520316B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢月明;S.F.哈塔克;李正劍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 百時(shí)美施貴寶公司
• 主分類號(hào): C07K14/705
• 分類號(hào): C07K14/705
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;黃希貴

本發(fā)明提供了通過優(yōu)化O?連接的糖基化位點(diǎn)的數(shù)量，減少糖蛋白聚集的方法。

本申請(qǐng)全文中參考了多種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容以其整體通過引用并入本申請(qǐng)，以更完整地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過優(yōu)化O-連接的糖基化位點(diǎn)的數(shù)量，減少糖蛋白聚集的方法。

發(fā)明背景

蛋白糖基化是決定生物制劑的功效和藥代動(dòng)力學(xué)長(zhǎng)效的重要質(zhì)量屬性。理解每個(gè)糖基化位點(diǎn)如何影響蛋白質(zhì)的整體功能有助于優(yōu)化最終產(chǎn)品質(zhì)量。通過達(dá)到均質(zhì)的糖基化譜，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的增加并確保產(chǎn)品的可比性。

O-連接的糖基化是指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖，或木糖中的一種糖連接到羥基氨基酸，最通常是絲氨酸或蘇氨酸。O-連接的糖殘基具有的結(jié)構(gòu)規(guī)則少于N-連接的糖基化，并且因此產(chǎn)生更大的糖型多樣性。由于缺少共有的識(shí)別序列，O-連接糖基化是難以預(yù)測(cè)的。然而，已開發(fā)出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法以更好地預(yù)測(cè)粘蛋白型O-連接的位點(diǎn)(Julenius, K等人，2005. Glycobiology 15, 153-164)。盡管迄今為止的大多數(shù)報(bào)道記載了O-多糖在糖蛋白結(jié)合能力或掩蔽其肽骨架中的作用，一個(gè)具體案例研究證實(shí)了具有更多O-連接的位點(diǎn)的促卵泡激素(FSH)類似物的生物活性低于具有更多N-連接的糖基化位點(diǎn)的FSH類似物(Weenen, C.等人，2004. J Clin Endocrinol Metab 89, 5204-5212)。已經(jīng)顯示O-連接的多糖對(duì)于糖蛋白gC-1的細(xì)胞表面表達(dá)是非必需的，但可干擾其表位的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其結(jié)合能力(Biller, M.等人，2000. Glycobiology 10, 1259-1269)。

認(rèn)為糖基化的存在影響商業(yè)生物制劑的免疫原性、功效、溶解度和半衰期(Lis,H.等人，1993. Eur J Biochem 218, 1-27；Lowe, J.B.等人，2003. Annu Rev Biochem72, 643-691；Van den Steen, P.等人，1998. Crit Rev Biochem Mol Biol 33, 151-208)。然而，大多數(shù)文獻(xiàn)集中于N-連接糖基化的影響(Hossler, P.等人，2009.Glycobiology 19, 936-949)。缺乏關(guān)于O-連接的糖基化對(duì)蛋白質(zhì)量的影響的信息，特別是關(guān)于蛋白聚集的信息。

蛋白治療劑在制造期間的聚集是不期望的，并且需要密集的下游加工以將其去除。因此，需要使蛋白聚集最小化，導(dǎo)致生產(chǎn)成本降低和加速的工藝過程優(yōu)化。O-連接的糖基化與治療性糖蛋白的聚集之間的關(guān)系的發(fā)現(xiàn)使得制造者能夠在產(chǎn)品開發(fā)早期改進(jìn)所述治療性糖蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了通過優(yōu)化O-連接的糖基化位點(diǎn)的數(shù)量，減少糖蛋白聚集的方法。所述糖蛋白可以是融合蛋白。所述融合蛋白可包含人免疫球蛋白的Fc區(qū)的鉸鏈部分。所述人免疫球蛋白可以是人IgG。

本發(fā)明提供了減少糖蛋白聚集的方法，其包括消除其中一個(gè)或多個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)。待消除的O-連接的糖基化位點(diǎn)可以在Fc結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)中。

本發(fā)明提供了減少糖蛋白聚集的方法，其包括通過氨基酸取代和/或刪除消除一個(gè)或多個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)。所述一個(gè)或多個(gè)取代和/或刪除的O-連接的糖基化位點(diǎn)可以在SEQ ID NO:5中所示的Fc結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)中。在SEQ ID NO:5中所示的Fc結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)中的可消除的O-連接的糖基化位點(diǎn)選自S248、T252、T254。所述一個(gè)或多個(gè)取代和/或刪除的O-連接的糖基化位點(diǎn)可以在SEQ ID NO:4中所示的突變的Fc結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)中。在SEQID NO:4中所示的Fc結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)中的可消除的O-連接的糖基化位點(diǎn)選自S129、S130、S136、S139、T133、T135。