[發(fā)明專(zhuān)利]無(wú)染色劑蛋白定量和標(biāo)準(zhǔn)化

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380034366.4
• 申請(qǐng)日: 2013-04-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104412097B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S·福瑞比;劉寧;K·麥克唐納德;A·保勒斯;A·珀什
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 生物輻射實(shí)驗(yàn)室股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/64
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/64;G01N21/76;G01N21/33;G01N33/52;G01N33/68;G06F19/20;G01J1/18;G01J3/443;C12Q1/06
• 代理公司: 上海專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司31100
• 代理人: 余穎

相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)要求2012年4月27日提交的標(biāo)題為“Stain-free total protein quantification of complex samples from diverse sources(來(lái)自多種來(lái)源的復(fù)雜樣品的無(wú)染色劑總蛋白定量)”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/639,692的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文以用于所有目的。本申請(qǐng)還要求2012年4月27日提交的標(biāo)題為“Stain-free technology for western blot total normalization(用于western印跡總體標(biāo)準(zhǔn)化的無(wú)染色劑技術(shù))”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/639,686的優(yōu)選權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文以用于所有目的。

發(fā)明背景

生物技術(shù)中的實(shí)驗(yàn)室過(guò)程通常包括單個(gè)蛋白的檢測(cè)、鑒定和定量。然而，除各混合物中的單個(gè)蛋白外，某些步驟還需要對(duì)整個(gè)蛋白混合物進(jìn)行定量，同時(shí)需要或不需要使單個(gè)蛋白彼此分離或區(qū)分。這類(lèi)總蛋白定量是有價(jià)值的，例如在比較來(lái)自不同樣品的蛋白量時(shí)，包括來(lái)自不同對(duì)象、不同生物體和不同物種，或者來(lái)自處于不同發(fā)育階段或疾病或疾病病癥的不同階段的同一物種或?qū)ο蟮臉悠贰Ｔ谶@些情況下，總蛋白測(cè)定可揭示基因表達(dá)的定量變化，在診斷、治療和治療劑的測(cè)試中具有價(jià)值?？偟鞍诇y(cè)定也可用于檢測(cè)分析系統(tǒng)中的樣品加載和蛋白轉(zhuǎn)移。例如，在將樣品加載至微孔板的單個(gè)孔或電泳凝膠的單條泳道中時(shí)，需要多個(gè)孔或泳道間具有均一和恒定的加載量以確保對(duì)樣品所進(jìn)行的任何分離或其他步驟中能夠做出適當(dāng)?shù)谋容^。蛋白轉(zhuǎn)移在例如Western印跡中發(fā)生，這也是受關(guān)注的領(lǐng)域，因?yàn)榭偟鞍锥靠娠@示印跡是否正確實(shí)施，或是否出現(xiàn)了不完全轉(zhuǎn)移。

使用常規(guī)染色劑(如COOMASSIE^TM亮藍(lán)(巴斯夫公司(BASF Aktiengesellschaft)，德國(guó)路德維希)、Ponceau S(西格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美國(guó)密蘇里州圣路易斯)和SYPRO RUBY^TM(西格瑪-艾爾德里奇公司)的蛋白檢測(cè)和定量是已知的。Edwards等在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US 7,569,103B2(2009年8月4日)和US 8,007,646B2(2011年8月30日)中公開(kāi)了無(wú)染色劑技術(shù)，其中引發(fā)色氨酸的吲哚部分和多個(gè)鹵素取代的有機(jī)化合物中任意一個(gè)(特別提到了氯仿、三氯乙醇和三氯乙酸)之間的UV光誘導(dǎo)的反應(yīng)以生成發(fā)射波長(zhǎng)在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的熒光化合物。該技術(shù)因此包括使用含鹵素試劑處理蛋白或其中存在蛋白的凝膠，使蛋白或凝膠暴露于UV光，并對(duì)所得單個(gè)蛋白條帶的發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)和定量。

色氨酸在蛋白中相對(duì)稀少，且各蛋白中色氨酸殘基與總氨基酸殘基的比例彼此間差異很大。基于此，對(duì)目前無(wú)染色劑技術(shù)應(yīng)用的認(rèn)識(shí)受到了限制。因此，已知該技術(shù)可用于比較同一蛋白的不同樣品，例如，通過(guò)比較各樣品中相同分子量蛋白的單個(gè)條帶的強(qiáng)度。不同樣品中不同蛋白條帶之間的比較是徒勞的，因?yàn)椴煌鞍缀芸赡芫哂胁煌纳彼岷?，因此無(wú)法預(yù)期在以相同量存在時(shí)產(chǎn)生相同的信號(hào)強(qiáng)度。然而，色氨酸差異不必然限制該技術(shù)在單個(gè)蛋白比較中的應(yīng)用。對(duì)來(lái)自同一來(lái)源的樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，總蛋白測(cè)定是有效的。該技術(shù)可用于印跡實(shí)驗(yàn)中，例如用于比較印跡前后凝膠中的無(wú)染色劑信號(hào)以確定任何蛋白是否仍存在于凝膠中。通過(guò)使用蛋白的已知濃度范圍構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并評(píng)估含未知量同一蛋白的樣品(前提是樣品中的蛋白量在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi))，該技術(shù)還可用于絕對(duì)定量。然而，在所有情況下，比較都是同一樣品在一些操作前后或者不同樣品中同一單個(gè)蛋白之間的直接比較。在這些情況下，不同蛋白之間色氨酸含量的任何差異都不會(huì)否定結(jié)果的有效性。

在研究樣品中感興趣的單個(gè)蛋白時(shí)，有時(shí)相對(duì)于樣品中一種或多種其他蛋白或者相對(duì)于樣品中的全部蛋白對(duì)該蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是有益處的。標(biāo)準(zhǔn)化是一種校正實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法，以適應(yīng)樣品稀釋、樣品加載或蛋白轉(zhuǎn)移不一致中的差異。例如，如果兩種不同細(xì)胞培養(yǎng)物被用作樣品，可能各培養(yǎng)物含有不同的細(xì)胞數(shù)目。如果兩種樣品中各細(xì)胞含有相同量的特定蛋白，則含有更多細(xì)胞的培養(yǎng)物含有更多的蛋白。在不知道一種樣品所含細(xì)胞多于另一種樣品的情況下，會(huì)不正確地總結(jié)出一種培養(yǎng)物中的平均細(xì)胞含有的蛋白多于另一種培養(yǎng)物中的平均細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)化用于校正這類(lèi)差異。