[發明專利]目標核酸的檢測方法

在審

• 申請號: 201380034120.7
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN104428424A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 平野泰亮;中村史夫;上田洋二;藤本健造
• 申請（專利權）人: 東麗株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/09
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 曽禎;段承恩

技術領域

本發明涉及利用夾心雜交法的目標核酸的檢測方法。

背景技術

各種生物的遺傳信息分析的研究已經開始，關于以人類基因為首的大量基因及其堿基序列、還有由基因序列所編碼的蛋白質和由這些蛋白質二次加工成的糖鏈的信息正在迅速被闡明。對于序列被闡明的基因、蛋白質、糖鏈等高分子體的功能，可以通過各種方法來調查。作為主要的方法，對于核酸，可以利用RNA印跡(northern?bloting)、或者DNA印跡(southern?bloting)這樣的各種核酸/核酸間的互補性來調查各種基因與其生物體功能表達的關系。對于蛋白質，可以利用以蛋白質印跡(western?bloting)為代表的蛋白質/蛋白質間的反應來調查蛋白質的功能和表達。

作為核酸檢測方法之一，已知夾心雜交法。夾心雜交法使用被固定于過濾器上的捕捉探針。捕捉探針與目標核酸的第1部分互補。在一個階段中，使結合于過濾器的捕捉探針暴露于應對于目標核酸序列進行調查的樣品，進一步暴露于與目標核酸的第2部分互補的帶有標記的檢測探針，但前述的第2部分與第1探針所互補的目標部分不同(即，與它們不重復)(專利文獻1、2、非專利文獻1)。該方法消除了在過濾器上固定化樣品所需的工夫，另外可以選擇第1探針使其適合支持體。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：美國專利第4,486,539號

專利文獻2：日本特開平7-75600號公報

非專利文獻

非專利文獻1：Sinikka?Parkkinen?et?al.,Journal?of?Medical?Virology20:279-288(1986)

發明內容

發明要解決的課題

目前，在捕捉探針固定化支持體上使用夾心雜交法來檢測目標核酸時，為了提高檢測靈敏度，必須使用相對于目標核酸量為過量的檢測探針。例如，根據文獻(日本特開2001-69997號公報)，相對于目標核酸量，需要25萬倍當量的檢測探針。但是，如果使用過量的檢測探針，則剩余的檢測探針與用于捕捉其他目標核酸的捕捉探針交叉雜交(非特異性吸附)，其結果存在檢測靈敏度(S/N比)降低這樣的課題。

本發明的目的是提供即使減小檢測探針的使用量，也不降低檢測靈敏度(S/N比)，能夠高靈敏度地檢測目標核酸的目標核酸的檢測方法。

用于解決課題的方法

本申請發明者們進行深入研究的結果發現，在夾心雜交法中，通過在目標核酸與檢測探針和/或捕捉探針雜交而形成的復合體中，在檢測探針和/或捕捉探針中替換了核酸堿基的光反應性基團與目標核酸中的核酸堿基之間通過光照射而形成共價鍵，從而不使用過量的檢測探針也能夠高靈敏度地檢測目標核酸，于是完成了本發明。

即，本發明提供以下(1)～(4)。

(1)目標核酸的檢測方法，是通過夾心雜交法來檢測目標核酸的方法，所述夾心雜交法使用與目標核酸雜交的檢測探針以及固定于支持體的捕捉探針，

檢測探針和/或捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替換為光反應性基團，

該檢測方法具有對目標核酸與檢測探針和/或捕捉探針雜交而形成的復合體進行光照射，從而在光反應性基團與目標核酸中的核酸堿基之間形成共價鍵的工序。

(2)根據(1)所述的檢測方法，檢測探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替換為光反應性基團。

(3)根據(2)所述的檢測方法，捕捉探針的核酸分子中的至少一個核酸堿基被替換為光反應性基團。

(4)根據(1)～(3)的任一項所述的檢測方法，光反應性基團是選自3-氰基乙烯基咔唑基、對氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4,5’,8-三甲基補骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基乙烯基尿嘧啶基中的至少1種。

發明的效果

根據本發明，能夠降低使用的檢測探針的量，因而能夠抑制與捕捉探針的交叉雜交(非特異性吸附)。其結果能夠提高檢測靈敏度(S/N比)，所以能夠高靈敏度地檢測微量的目標核酸。

具體實施方式