[發(fā)明專利]分析樣品組分的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380033940.4
• 申請(qǐng)日: 2013-05-02
• 公開（公告）號(hào): CN104411383A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·麥吉夫尼;朱貴杰;N·多維奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 米迪繆尼有限公司;圣母大學(xué)
• 主分類號(hào): B01D59/50
• 分類號(hào): B01D59/50
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

發(fā)明背景

重組蛋白作為治療劑變得日益重要。重組蛋白可以使用細(xì)胞株制造，例如非人類哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞株，這些細(xì)胞株被工程改造成表達(dá)特定人類基因序列以產(chǎn)生所關(guān)注的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生目標(biāo)蛋白后，該目標(biāo)蛋白可以通過已知工藝純化到高純度水平。然而，由宿主細(xì)胞株產(chǎn)生的痕量污染蛋白(稱為宿主細(xì)胞蛋白或HCP)可以存在于耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物中。

HCP可以潛在地影響產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。因此，重要的是對(duì)存在于治療性產(chǎn)品中的HCP進(jìn)行表征以減低這些風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)HCP的當(dāng)前表征方法(如二維凝膠電泳)傾向于勞動(dòng)密集的和繁瑣的，這可以限制這些用于HCP表征的方法的使用，尤其在商業(yè)生產(chǎn)期間。

電泳是指離子通過電場中的吸引或排斥作出的不同移動(dòng)或遷移。毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)是基于樣品組分等電點(diǎn)(pI)差異的高分辨率分離技術(shù)并且適合用于分離兩性物質(zhì)，如氨基酸、肽以及藥物。在cIEF中，蛋白質(zhì)在電場的影響下通過由載體兩性電解質(zhì)(CA)形成的pH梯度遷移。帶正電荷的兩性電解質(zhì)朝著陰極遷移，而帶負(fù)電荷的兩性電解質(zhì)朝著陽極遷移。因此，pH朝著毛細(xì)管的陰極端增大而朝著陽極端減小。在兩性電解質(zhì)到達(dá)自身pI并且不再帶電時(shí)，遷移停止，引起穩(wěn)定pH梯度的形成。兩性分析物將最終遇到它會(huì)具有零凈電荷的pH并且將因此停止遷移，引起分析物利用pI的聚焦或分離。cIEF已與許多檢測技術(shù)(包括UV吸光度、激光誘發(fā)的熒光以及質(zhì)譜(MS))偶聯(lián)。

質(zhì)譜(MS)是將化合物電離以產(chǎn)生帶電分子或分子片段的分析技術(shù)，這些分子或分子片段接著根據(jù)它們的質(zhì)荷比在分析器中使用電磁場分離。接著，可以對(duì)所分離的離子進(jìn)行檢測和分析。

大氣壓電離(API)來源可以用于將樣品分子在大氣壓下電離并且接著將這些離子轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀中。API適于電離熱不穩(wěn)定樣品，如聚合物和肽。電噴霧電離(ESI)是API應(yīng)用，該應(yīng)用時(shí)常用于熱不穩(wěn)定和高分子量化合物(如聚合物和肽，它們是低或非揮發(fā)性的)的MS。

然而，用于生物樣品(尤其蛋白質(zhì)降解物)的cIEF與ESI-MS的在線偶聯(lián)已具挑戰(zhàn)性。因此，需要改進(jìn)的用于生物樣品的cIEF與ESI-MS的在線偶聯(lián)。

發(fā)明概述

在此描述了用于鑒別并分析樣品中的一種或多種組分的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該樣品包括異質(zhì)的生物分子混合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，該樣品包括重組蛋白耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物。在更特定實(shí)施例中，一種或多種組分包括宿主細(xì)胞蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，該樣品包括重組單克隆抗體耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物并且一種或多種樣品組分包括宿主細(xì)胞蛋白。在更具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于鑒別耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)組分的方法。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括以下步驟：(a)通過毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)分離該樣品中的一種或多種組分；(b)使用鞘流溶液將分離的組分從分離腔室轉(zhuǎn)移到電離儀器；(c)將這些樣品組分電離；并且(d)通過質(zhì)譜(MS)鑒別并分析該樣品中的一種或多種組分。在一個(gè)實(shí)施例中，該電離儀器包括電噴霧電離(ESI)儀器。

在本發(fā)明的方法中，該鞘流溶液既充當(dāng)用于該分離腔室的動(dòng)員溶液又充當(dāng)用于該電離儀器的電離溶液。在更具體實(shí)施例中，該鞘流緩沖液包含在約30％與約50％之間的極性有機(jī)溶劑和在約0.01％與0.1％之間的有機(jī)酸。該極性有機(jī)溶劑可以是極性質(zhì)子溶劑或極性非質(zhì)子溶劑。在一個(gè)實(shí)施例中，該極性質(zhì)子溶劑包括脂肪醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇以及其組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，該極性非質(zhì)子溶劑包括乙腈。在一個(gè)實(shí)施例中，該有機(jī)酸是選自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其組合。在一個(gè)實(shí)施例中，該有機(jī)酸的pKa在約4.0與5.0之間。在更具體實(shí)施例中，該鞘流溶液包含在約30％與約50％之間的脂肪醇和在約0.01％與0.1％之間的甲酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該鞘流溶液包含在約30％與約50％之間的甲醇和在約0.01％與0.1％之間的甲酸。

在一個(gè)實(shí)施例中，分離包括以下步驟：(a)將一定體積的該樣品和兩性電解質(zhì)緩沖液引入到該分離腔室中，其中該分離腔室包括毛細(xì)管；并且(b)在高達(dá)約50kV的聚焦電壓下將該樣品和該兩性電解質(zhì)緩沖液在該分離毛細(xì)管中聚焦。在更具體實(shí)施例中，該聚焦電壓是在約5kV與約50kV之間。在一個(gè)實(shí)施例中，該樣品在介于約300V/cm與約600V/cm之間的外加電場下聚焦。在更具體實(shí)施例中，該外加電場是在約300V/cm與約400V/cm之間。