[發(fā)明專利]生產(chǎn)D-乳酸的新型菌株及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380033424.1
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN104395456A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁殷彬;李泰熙;金善慧;梁榮烈;李紅仙
• 申請（專利權(quán)）人: CJ第一制糖株式會(huì)社
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及新型D-乳酸生產(chǎn)菌株及其用途。具體地，本發(fā)明涉及制備D-乳酸生產(chǎn)菌株的方法，其包括以下步驟：抑制L-乳酸生產(chǎn)菌株中L-乳酸脫氫酶(L-LDH)活性并引入D-乳酸脫氫酶(D-LDH)活性；通過上述方法制備的修飾的D-乳酸生產(chǎn)菌株；和生產(chǎn)D-乳酸的方法，其包括以下步驟：培養(yǎng)菌株和從培養(yǎng)肉湯(culture?broth)中回收D-乳酸。

2.相關(guān)技術(shù)的描述

乳酸在食品、藥品、化妝品等方面具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用。近幾年，乳酸已被用作聚乳酸單體，從而對乳酸的需求有了顯著的增長。

可通過化學(xué)合成或通過使用碳水化合物作為底物的生物發(fā)酵方法生產(chǎn)乳酸。從商業(yè)角度來看優(yōu)選后者，因?yàn)槿樗岬幕瘜W(xué)合成會(huì)引起由氣體價(jià)格上漲造成的成本增加或環(huán)境污染的問題。此外，還存在的問題有生成由等量的D-乳酸和L-乳酸組成的外消旋混合物形式的L-乳酸。不幸的是，無法控制D-乳酸和L-乳酸的組成比率。當(dāng)使用外消旋混合物形式的乳酸制備聚乳酸時(shí)，產(chǎn)生低熔點(diǎn)的無定形聚合物，從而限制了其應(yīng)用。另一方面，使用微生物的生物發(fā)酵方法可依據(jù)所使用的菌株而選擇性地生產(chǎn)D-乳酸或L-乳酸。例如，諸如乳桿菌(Lactobacillus?sp.)、芽孢桿菌(Bacillus?sp.)、根霉菌(Rhizopus?sp.)、鏈球菌(Streptococcus?sp.)或腸道球菌(Enterococcus?sp.)的微生物通常生產(chǎn)L-乳酸。諸如明串珠菌(Leuconostoc?sp.)和Lactobacillus?vulgaricus的微生物通常生產(chǎn)D-乳酸。尤其是，由于D-乳酸不在體內(nèi)代謝，D-乳酸可作為生物材料應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域并且通過酯化作用和氯化作用還可用作光學(xué)活性除草劑。已經(jīng)知道，光學(xué)活性除草劑可以顯著提高其藥效并且用較小的量也有相同的藥效。為此，對D-乳酸的需求不斷增加。此外，sc-聚乳酸(立構(gòu)復(fù)合物-PLA)的熔點(diǎn)和熱降解溫度明顯高于已知的聚乳酸。因此，其可用作由純L-聚乳酸和純D-聚乳酸的混合物所產(chǎn)生的高耐熱性塑料材料。因此，需要D-乳酸單體，并且它的需求正在逐漸增加。

在生產(chǎn)此類光學(xué)純D-乳酸中，優(yōu)選采用微生物酶的對映選擇性底物特異性的生物發(fā)酵方法。然而，通常發(fā)現(xiàn)于自然界中的野生型D-乳酸生產(chǎn)微生物就光學(xué)純度和生產(chǎn)率而言仍不適用于工業(yè)用途。D-乳酸生產(chǎn)微生物的例子為植物乳桿菌(Lb.plantarum)、戊糖乳桿菌(Lb.pentosus)、發(fā)酵乳桿菌(Lb.fermentum)、德氏乳桿菌(Lb?delbrueckii)等。然而，存在的缺點(diǎn)有，它們不能以高生產(chǎn)率和高收率生產(chǎn)乳酸，并且20～40％的乳酸是作為光學(xué)雜質(zhì)的L-乳酸。為了克服這些缺點(diǎn)，進(jìn)行了許多嘗試，以通過用EMS(甲基磺酸乙酯)處理誘導(dǎo)乳酸生產(chǎn)細(xì)菌中的突變從而開發(fā)在高葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)高濃度乳酸的變體(J.Industrial?Microbiol,11:23-28,1992)。結(jié)果，選出顯示比對照組高約4.8倍生產(chǎn)率的菌株，但是其活性在長期儲(chǔ)存過程中會(huì)降低。同時(shí)，在使用變體進(jìn)行菌株開發(fā)的情況下，收率改進(jìn)的菌株傾向于顯示降低的生產(chǎn)率，而生產(chǎn)率改進(jìn)的菌株傾向于顯示降低的收率。

基于這樣的構(gòu)思：用于工業(yè)乳酸發(fā)酵的菌株通常是L-乳酸生產(chǎn)微生物，并且這些微生物相比于D-乳酸生產(chǎn)微生物大多數(shù)都有優(yōu)異的生產(chǎn)率和收率，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以通過在高L-乳酸生產(chǎn)微生物中使L-乳酸脫氫酶(L-LDH)編碼基因失活，然后在其中引入異源D-乳酸脫氫酶(D-LDH)編碼基因而以高收率生產(chǎn)D-乳酸，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明概述

本發(fā)明的實(shí)施方式提供制備修飾的D-乳酸生產(chǎn)菌株的方法，其包括以下步驟：在L-乳酸生產(chǎn)菌株中使L-乳酸脫氫酶活性減弱或失活并使D-乳酸脫氫酶活性引入或增強(qiáng)。

本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供修飾的D-乳酸生產(chǎn)菌株，該菌株通過上述方法制備。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供使用修飾的D-乳酸生產(chǎn)菌株生產(chǎn)D-乳酸的方法。

附圖簡述

圖1顯示了一張圖表，其呈現(xiàn)出由10種不同類型的野生型乳酸生產(chǎn)微生物生產(chǎn)的D-乳酸和L-乳酸比率的分析結(jié)果。

優(yōu)選實(shí)施方式詳述

本發(fā)明的實(shí)施方式提供通過在L-乳酸生產(chǎn)菌株中使L-乳酸脫氫酶(L-LDH)活性減弱或失活并使D-乳酸脫氫酶(D-LDH)活性引入或增強(qiáng)而制備修飾的D-乳酸生產(chǎn)菌株的方法。