[發(fā)明專利]聚合物的測量的分析

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380020403.6
• 申請日: 2013-02-18
• 公開（公告）號: CN104321441B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 斯圖爾特·威廉·里德;詹姆斯·安東尼·克拉克;詹姆斯·懷特;加文·哈珀
• 申請（專利權(quán)）人: 牛津楠路珀?duì)柨萍加邢薰?/a>
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;B82Y15/00;G01N33/487;G06F19/22
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 余剛;張英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及分析在聚合物通過納米孔的易位過程中進(jìn)行的包含聚合物單元的聚合物，例如但不限于多核苷酸的測量的領(lǐng)域。

背景技術(shù)

通常，通過使用膜限制溶液的兩個池之間的物質(zhì)流動，進(jìn)行納米孔測量。提供在膜中的孔以允許物質(zhì)從溶液的一個池轉(zhuǎn)移到另一個。孔具有納米尺度上的至少一個尺寸。隨著物質(zhì)通過孔易位，測量該物質(zhì)。最常用的設(shè)置依賴施加電壓的應(yīng)用以驅(qū)動分子物種通過納米孔。將電極放置在每個溶液體積中，并且溶液包含電解質(zhì)，通常為鹽，如1?M?NaCl。在電極之間施加的電壓還驅(qū)動電解質(zhì)通過孔并且產(chǎn)生電流。當(dāng)物質(zhì)通過孔時，其改變在電流測量中直接觀察到的離子的流動。電流阻塞的程度和物質(zhì)花費(fèi)在納米孔中的持續(xù)時間指示物質(zhì)的特性。

通過使聚合物通過納米孔來分析聚合物的原始概念由Branton等人(US-5,795,782)在1996年提出。在這種情況下，DNA分子通過嵌入在脂膜中的納米孔。將電極放置在膜的每一側(cè)上，并且施加的電壓用于驅(qū)動DNA分子從膜的一側(cè)至另一側(cè)。在DNA分子的易位過程中，測量通過孔的跨膜電流。示出的是：當(dāng)DNA通過納米孔時，DNA的不同序列將引起不同的觀察電流。使用核苷酸的均聚物進(jìn)行這些早期實(shí)驗(yàn)，其中，聚合物自由地易位納米孔。在這些實(shí)驗(yàn)中，聚合物易位的速率非常快(～5μs/堿基)，造成聚合物中的單個核苷酸的特性難以確定。

為了克服快速DNA易位的限制，Branton等人公開了使用聚合酶以控制DNA通過納米孔易位的速度。該優(yōu)雅方案已經(jīng)被本領(lǐng)域中的許多研究者采用并修改，其已經(jīng)導(dǎo)致了許多出版物。基本概念是給聚合物的運(yùn)動提供棘輪，這可以包括分子發(fā)動機(jī)或分子制動。

早期研究集中在使用聚合酶來控制DNA的運(yùn)動。使用Klenow片段進(jìn)行了許多研究，但這些實(shí)驗(yàn)受限于納米孔頂部上的DNA-酶復(fù)合物的短持續(xù)時間。研發(fā)了許多方案以補(bǔ)償這種弱結(jié)合(例如，參見Olasagasti等，Nat?Nanotechnol.2010?Nov；5(11):798-806，Ashkenasy等，Angew?Chem?Int?Ed?Engl.2005?Feb?18；44(9):1401-4)。

在2010，Akeson等人公開了Phi29?DNA聚合酶(DNAP)可以在納米孔的頂部上起作用(例如，參見Lieberman等，J?Am?Chem?Soc.2010?Dec22；132(50):17961-72,61/402,903)。Phi29?DNAP粘合至模板DNA的強(qiáng)度足以允許在納米孔的頂部上進(jìn)行多重酶循環(huán)，從而，允許以棘輪方式拉動DNA通過納米孔。文章還披露了在其中抑制酶運(yùn)動的條件下，Phi29?DNAP可以用于控制DNA運(yùn)動通過納米孔。在這些條件下，對于酶促作用而言必不可少的Mg2+有效地通過加入金屬螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)去除。施加的電壓提供了DNA鏈上的力，并且Phi29?DNAP通過孔限制鏈的“拉開(unzipping)”。該研究表明納米孔系統(tǒng)中的酶可以起分子發(fā)動機(jī)的作用或起分子制動的作用。

除了使用聚合酶作為分子棘輪之外，已經(jīng)證明的是：一些解旋酶家族可以用于提供控制多核苷酸運(yùn)動通過納米孔(例如，參見US?61/549,998(N115020)、US?61/581,332(N115505)、US?61/581,340(N115506))。解旋酶(helicase)具有許多使得它們適合用于納米孔系統(tǒng)的性能。

減緩靶單鏈DNA易位的替代方法是沿著靶鏈的長度雜交ssDNA(hyb-DNA)的附加部分。在施加的電壓下，DNA的靶鏈迅速穿過孔。一旦鏈的雙鏈部分到達(dá)納米孔的收縮處，鏈的易位停止，允許在固定位置處讀取聚合物的電流。通過外加場的力，hyb-DNA部分未雜交，并且靶DNA鏈繼續(xù)易位納米孔直至遇到另一個hyb-DNA。以這種方式，獲得了在多個固定位置處針對DNA鏈的電流標(biāo)記。通過使用復(fù)雜樣品制備技術(shù)，Derrington等人提出使用該方法測序DNA鏈的方法。

從這些方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)共享主要特征；DNA的易位發(fā)生在謹(jǐn)慎的階段，其中，每一個階段代表納米孔中的聚合物的位置并且每一個聚合物位置具有特征電流水平。有時，電流水平可以表現(xiàn)出波動，稱為偏差。這些特征導(dǎo)致了采用“嘈雜階梯波(noisy?step?wave)”形式的信號。