[發明專利]基質干細胞

有效

• 申請號: 201380019351.0
• 申請日: 2013-02-11
• 公開（公告）號: CN104302763B
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: S·J·埃利曼
• 申請（專利權）人: 奧爾布森治療學有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/28
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 江側燕

引言

本發明涉及分離干細胞的方法，涉及由分離的細胞獲得的干細胞群和涉及那些細胞群、由那些細胞群獲得的細胞和組織的用途。

背景技術

在20世紀60-70年代，Friedenstein及其同事證明了成骨潛能-由骨髓(BM)細胞的異位移植所揭示-與BM-單核細胞(MNCs)的次要亞群相關(在Friedenstein，1990中綜述)。這些MNCs與造血MNC的區別在于它們快速附著到塑料組織培養容器上，以及它們的后代在培養時具有成纖維細胞樣外觀，暗示著來源于BM的基質區室(stromal compartment)。在建立BM基質源的同時，Friedenstein、Owen及其同事提供了第二個突破，其表明將BM細胞懸液以克隆密度接種會導致單個細胞產生分離集落(colony-forming unit fibroblastic,CFU-F(《成纖維細胞的集落形成單位，CFU-F》)[Friedenstein等人，1970])。

Friedenstein和Owen后來將這種CFU-F形成細胞稱為基質干細胞(SSC)(Owen和Friedenstein，1988)，此處提到的SSC基于該原始細胞定義。

BM衍生的SSC可在塑料粘附的(PA)、成纖維細胞的MNC的混合群體中被識別出，所述MNC生成骨、脂肪或軟骨以及分泌有效的免疫調節和血管生成蛋白。臨床前研究表明，PA-SSC介導體內有效的免疫調節和血管形成應答。目前，臨床試驗在40種不同的退行性、自身免疫性和缺血性疾病中測試PA-SSC。

在人骨髓中，每80,000個MNC中大約有1個BM單核細胞(MNC)是形成SSC的CFU-F。到目前為止，從BM中分離這些SSC所使用的最簡單和頻繁的方法取決于之前提到的對組織培養塑料制品的附著，據此，將MNC培養10-14天，在此期間，CFU-F將以認可的1:80000的頻率附著和形成集落。在10-14天，通過胰蛋白酶消化收獲這些CFU-F，并以3-8000CFU-F/cm²的密度再接種于富血清培養基中。然后，在體外繁殖這些CFU-F，直至獲得足夠的細胞數量以能夠進行生物化學和細胞學評估。這種方法被廣泛使用，但是對于臨床用途，被認為是不足以定義或純化SSC的，因為僅有1:80,000接種的BMMNC是SSC，并且這些方法不符合相關產品獲得臨床批準所需要的藥品生產質量管理規范。

因此，現有技術已基于附著到塑料表面的初始能力來鑒別干細胞群。經過這一初始的篩選，從表面的單獨集落形成單位獲得作為克隆群體的細胞群。盡管該術語可能不準確，但這些在文獻中也已被標記為“間充質干細胞”，因為非間充質干細胞可包括在分離的細胞內。在已知的分離方法中，這些已知的細胞群衍生自對堿性磷酸酶(ALP)和CD271呈陽性的干細胞。但是，在臨床方面，該細胞基本上未被鑒別。

從這些已知的分離細胞制備(例如從單個分離細胞經克隆擴大)細胞群，并用于移植。但是，結果是變化的，移植的細胞群在批次與批次之間有時表現得相當不同，具有不可預測的因素。

現有技術的細胞群往往形成骨和脂肪及軟骨，但經過有限的控制，在需要骨或軟骨時，經常形成脂肪。相反，例如，在優選獲得形成脂肪的細胞時，卻僅僅不可靠地獲得這些產生脂肪的細胞。

一個重要的問題是，起始細胞群基本上是未被確定的，因為基于附著塑料的分離不是對細胞類型的充分技術確定。例如，即使以提到的標記物(ALP和CD271)用于選定時，細胞或后代中那些標記物的表達在培養時也會快速消失，留下效果上未確定的群體。細胞的有用性質還會隨著時間而減少或消失——未確定的細胞群的另一個問題。

發明目的

本發明的一個總目的是提供分離基質干細胞和細胞群及由其獲得的組織的方法，該方法至少是現有技術的一種替代；本發明特定實施方式的一個目的是提供改進的方法，例如通過增強所獲細胞的確定，或提供改進的細胞或組織，例如通過增強其性質的可靠性，使它們更適合臨床應用。

發明內容

本發明基于基質干細胞特別是人基質干細胞的預期分離，基于在多種哺乳動物中表達的標記物或抗原的表達。在本發明的方法和細胞群中，細胞基于特定的跨物種標記物的表達來進行分選，這被稱為預期分離，然后培養獲得的細胞，留至細胞鑒別，即可克隆擴增的成纖維細胞的集落形成單位(CFU-Fs)?？寺U增后獲得的細胞群接著計劃用于治療、移植和其它用途。