[發(fā)明專利]免疫層析檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380015412.6
• 申請(qǐng)日: 2013-03-13
• 公開（公告）號(hào): CN104204802A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伊藤大輔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 田中貴金屬工業(yè)株式會(huì)社
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543
• 代理公司: 北京天昊聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業(yè)平;常海濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抑制非特異性反應(yīng)的具有高性能和高靈敏度的免疫層析檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明涉及一種通過(guò)抑制非特異性反應(yīng)從而能夠迅速、簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地檢驗(yàn)/測(cè)量樣品中的檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè)試劑盒。

更具體而言，本發(fā)明涉及一種通過(guò)保護(hù)被金屬納米顆粒標(biāo)記的標(biāo)記物并使其穩(wěn)定化以對(duì)抗干燥處理或干燥狀態(tài)并抑制非特異性反應(yīng)，從而迅速、簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地檢驗(yàn)樣品中的檢測(cè)對(duì)象的方法，其中所述標(biāo)記物用于對(duì)檢測(cè)對(duì)象(待檢測(cè)物質(zhì))進(jìn)行檢測(cè)，即，該標(biāo)記物為一種敏化的金屬膠體，其中，金屬膠體被與檢測(cè)對(duì)象發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)敏化。

背景技術(shù)

近年來(lái)，作為一種基于利用抗體的特異反應(yīng)性來(lái)檢測(cè)樣品液中的抗原的簡(jiǎn)單且便利的體外診斷試劑盒或便攜式診斷裝置，用于免疫層析法的試紙型免疫測(cè)定法的重要性日益增加，所述免疫測(cè)定法不需要對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理。具體而言，用于病毒或細(xì)菌等病原體的檢驗(yàn)試劑盒是在普通醫(yī)院或門診中廣泛使用的常見免疫層析裝置。

免疫層析裝置的最簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)為樣品添加部位、標(biāo)記物保持部、判定(檢測(cè))部位、免疫層析用多孔支持體和樣品吸收部位相互連接的結(jié)構(gòu)。標(biāo)記物保持部已經(jīng)通過(guò)以下方式生產(chǎn)：用保護(hù)性穩(wěn)定化溶液處理用于檢測(cè)檢測(cè)對(duì)象的、已被金屬納米顆粒標(biāo)記的標(biāo)記物(以下也稱作綴合物(conjugate))，然后用所述標(biāo)記物浸漬或涂布免疫層析用多孔載體，隨后進(jìn)行空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥等。

作為保護(hù)性穩(wěn)定化溶液，迄今為止，含有牛血清白蛋白(BSA)等蛋白質(zhì)作為保護(hù)性穩(wěn)定劑的那些是已知的，但是存在如下問(wèn)題：它們不能在干燥狀態(tài)下長(zhǎng)期維持穩(wěn)定，因而人們已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步改善和研究。例如，已經(jīng)報(bào)道了含有酪蛋白、乳清蛋白或酪蛋白分解產(chǎn)物的保護(hù)性穩(wěn)定化溶液(見專利文獻(xiàn)1)。

另外，作為對(duì)多種免疫測(cè)定法中的標(biāo)記抗體的保護(hù)和穩(wěn)定化，已知如下技術(shù)：向金膠體中添加生物分子(例如，抗體等)，然后通過(guò)向其中摻入被硫醇基(thiol)和/或二硫基取代的聚乙二醇來(lái)保護(hù)并穩(wěn)定該綴合物(即，使顆粒的聚集降至最低并使能夠吸附的自由表面飽和)(見專利文獻(xiàn)2)。

另外，作為能夠以干燥狀態(tài)長(zhǎng)期穩(wěn)定貯存固相免疫試劑的一種保護(hù)性穩(wěn)定化溶液，已經(jīng)提出了由20％至80％的糖(如海藻糖)和0.5mol/L至2mol/L的緩沖液組成的保護(hù)性穩(wěn)定化溶液(見專利文獻(xiàn)3)。

另外，為了改善含有敏化金屬膠體的凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性，已知如下技術(shù)：在將含有敏化金屬膠體的溶液凍干時(shí)，向其中摻入海藻糖、單精氨酸谷氨酸鹽、色氨酸、氯化鈣等中一種或多種(見專利文獻(xiàn)4)。

另外，作為蛋白質(zhì)(特別是貯存于水溶液中并在貯存三個(gè)月后診斷準(zhǔn)確度輕微下降的酶)貯存性優(yōu)異的體外診斷藥物組合物，已經(jīng)報(bào)道了可以通過(guò)向其中額外摻入胍(其鹽)或精氨酸(其鹽或其衍生物)作為穩(wěn)定劑來(lái)解決在水溶液中引起蛋白質(zhì)聚集、水解等問(wèn)題(見專利文獻(xiàn)5)。

另一方面，關(guān)于免疫層析裝置，存在以下常見問(wèn)題：背景著色(判定部處除固定相抗體以外的其他部分的著色)、空白顯色(在檢測(cè)物不存在的情況下固定相的顯色)和前帶現(xiàn)象(假陰性現(xiàn)象，其中當(dāng)使用過(guò)量的檢驗(yàn)物質(zhì)作為樣品時(shí)，明顯觀察到檢驗(yàn)物質(zhì)似乎以較少的量存在)，這些問(wèn)題不僅在檢測(cè)時(shí)降低SN率，還引起功能異常。

背景著色由可視化的流動(dòng)相抗體與多孔載體之間的疏水性結(jié)合引起，空白顯色由具有負(fù)電荷的流動(dòng)相抗體與具有正電荷的固相載體之間的電相互作用引起，這又稱作非特異性顯色。另外，前帶現(xiàn)象認(rèn)為歸因于如下事實(shí)：未能與標(biāo)記物反應(yīng)的過(guò)多檢測(cè)物質(zhì)與判定部發(fā)生反應(yīng)，并且被金屬顆粒標(biāo)記的用于檢出檢測(cè)物質(zhì)的標(biāo)記物不能與判定部反應(yīng)。

作為對(duì)策，已經(jīng)從各種角度進(jìn)行了眾多研究。例如，在利用含有pH緩沖劑等的展開液的免疫層析檢測(cè)方法中，已使用了各種添加劑以用于抑制因生物親和力所致的副反應(yīng)或用于抑制非特異性反應(yīng)，這類添加劑的例子包括：用于促進(jìn)抗原-抗體反應(yīng)或用于抑制非特異性反應(yīng)的蛋白質(zhì)(例如，牛血清白蛋白、酪蛋白、明膠等)、高分子化合物(例如，聚乙二醇、葡聚糖、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等)、非離子型表面活性劑(例如，Tween20、Triton?X-100等)、離子型表面活性劑或聚陰離子(例如，硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等)或它們的鹽，等等(見專利文獻(xiàn)6)。