[發明專利]具有葉中改變的硝酸鹽水平的轉基因植物

在審

• 申請號: 201380015390.3
• 申請日: 2013-03-19
• 公開（公告）號: CN104395473A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: S.達文波特;P.勒萊;J.P.桑切斯坦布里諾
• 申請（專利權）人: 英美煙草(投資)有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李慧惠;呂彩霞

技術領域

本發明涉及可以用于制備轉基因植物的遺傳構建體。構建體可以具有降低植物特別是植物的葉中硝酸鹽濃度的能力。本發明擴展至用此類構建體轉化的植物細胞和轉基因植物本身。本發明還涉及產生轉基因植物的方法和在植物中降低硝酸鹽含量的方法。本發明還提供用于改變植物氨基酸概況的方法。本發明還涉及已用遺傳構建體轉化的收獲的植物葉(例如煙草葉)和包含此類收獲的植物葉的各種煙草制品(諸如吸煙制品)。

背景

氮同化對于植物生長具有根本重要性。在植物所需的所有礦物質營養物中，氮是最大豐度需要的。在田間植物攝取的氮的主要形式是硝酸鹽和氨，其是氮肥的主要組分。根據可用性，植物從土壤中攝取硝酸鹽或銨離子。硝酸鹽在充分氧化的非酸性土壤中會更豐富，而銨會在酸性或積水土壤中占優勢。對煙草生長參數的實驗清楚地表明，相對生長速率、葉綠素含量、葉面積和根面積響應于漸增的硝酸鹽供應而急劇增加。

植物已經發展了非常高效氮攝取系統以處理耕種土壤的硝酸鹽含量的巨大變化。植物根通過特定硝酸鹽轉運蛋白(NTR)的作用攝取硝酸鹽和氨。已經顯示兩個硝酸鹽轉運系統共存于植物中，NRT1基因家族和NRT2基因家族。據信，兩個轉運蛋白家族合作地作用以便從土壤攝取硝酸鹽并將其分布在植物各處。通常假定NRT1基因家族介導根低親和力轉運系統(LATS，即當外部硝酸鹽濃度>1?mM時)，而NRT2基因家族介導高親和力轉運系統(HATS，即當外部硝酸鹽濃度<1?mM時)。在擬南芥中，已知七個基因屬于NRT2基因家族。還已知，這些基因的表達受植物暴露的硝酸鹽的濃度調節。然而，除了Atnrt2.1、Atnrt2.4和Atnrt2.7，其它NRT2基因的功能尚未闡明。

NRT2基因家族的最佳表征成員之一是Atnrt2.1。在擬南芥中，AtNRT2.1與NAR2?(AtNRT3)蛋白相互作用，以形成HATS的重要組分。擬南芥中AtNRT2.1硝酸鹽轉運蛋白的突變的、非功能性形式的過表達引起高親和力硝酸鹽攝取系統活性的顯著降低和葉片硝酸鹽含量的降低。作為結果，當擬南芥在低硝酸鹽濃度中生長時，這些Nrt2.1突變體植物的生長受到嚴重損害。

Nrt2.7是表征不足的基因。已知其在植物種子，特別是在液泡膜中表達，并且其調節植物種子的硝酸鹽含量。最近已經表征了硝酸鹽轉運蛋白Nrt2.4。NRT2.4蛋白參與在非常低的外部濃度下植物的根對硝酸鹽的攝取和將硝酸鹽裝載到植物枝條的韌皮部。

硝酸鹽轉運蛋白、和硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶的活性調節在整個植物中控制主要氮同化中是關鍵的，且對于植物的生長和發育具有顯著影響。然而，在某些條件下，硝酸鹽可能積累，主要是在綠色光合活躍組織中積累，在那里它被儲存在葉肉細胞的液泡中。當具有較低同化儲存的硝酸鹽的光合能力時，或作為土壤中高硝酸鹽水平的結果，高水平的硝酸鹽積累可以在低溫和/或太陽輻射(例如，在冬季期間的溫室作物中)期間發生。硝酸鹽水平的增加可以具有許多有害后果，不僅在植物生長的方面，而且在消耗植物的人或動物健康以及環境后果的方面。硝酸鹽積累的許多不利后果通過產生亞硝酸鹽所介導。

因此，為了防止硝酸鹽聚集，一個策略將是增加植物中的氮再動員(nitrogen?remobilisation)，例如當它們變得衰老時，這可能在作物生產中具有重要應用。首先，從葉再動員的氮可以被轉運至較嫩葉以及正在發育的種子。增強氮從衰老葉離開的效率因此可以潛在增加對植物的種子和較嫩部分的氮供給，從而增加作物產量和氮使用效率。當世界人口不斷增加，但作物產量沒有增加到足以滿足需求時，這顯然是有價值的目標。一種潛在的目標作物是歐洲油菜(Brassica?napus)(油菜)，其由于從營養組織的差的氮再動員而具有差的氮效率。另一個目標作物是小麥，因為增強籽粒蛋白含量的潛在益處是巨大的。籽粒蛋白含量不僅影響小麥的營養價值，而且決定籽粒使用，并因此決定市場價值。例如，增加的籽粒蛋白含量導致增加的面包體積。

此外，增加氮再動員的能力在煙草行業中可以是非常有用的，因為已知煙草葉中的殘余氮有助于亞硝胺類的形成，如圖1所示。具體而言，硝酸鹽和亞硝酸鹽在烤葉(cured?leaf)中充當煙草特異性亞硝胺(TSNA)形成的前體。煙草工業對煙草葉的處理涉及去除被認為充當硝酸鹽儲存器官的烤葉的葉柄和中脈，其缺乏味道且TSNA高。