[發明專利]用于酶穩定化的相容性溶質四氫嘧啶及其衍生物

有效

• 申請號: 201380012775.4
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN104145023B
• 公開（公告）日: 2016-11-09
• 發明（設計）人: G.開姆尼蒂厄斯;O.加;T.納格爾;K.雷赫特
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;梁謀

本發明涉及用于維持和保護酶活性的工具和方法。特別地，本發明涉及干燥組合物，其包含脫氫酶、氧化還原輔因子、在存在氧化還原當量的條件下能引起指示劑的光學性質的至少一種光學變化的試劑、指示劑、以及至少一種相容性溶質，所述相容性溶質是四氫嘧啶(ectoine)或其衍生物。本發明進一步考慮用于測定來自體液樣品的被分析物的診斷性測試元件和制造這種測試元件的方法。本發明進一步設想了如上所述的至少一種相容性溶質在減少干燥條件下組合物中至少一種酶的酶活性的降低中的應用。此外，根據本發明，考慮了基于測試元件測定體液樣品中被分析物的存在或量的方法。

通常制造診斷性測試元件用于快速診斷應用。因此，該元件對于處理和儲存來說應當是穩健的。這特別適用于測試元件的測試化學。(參見H?nes?2008,?Diabetes?Technology?&?Therapeutics?10:?S10)。

但是，許多診斷性測試元件是基于測試元件上存在的相當復雜的酶測試化學的。特別是，測試元件包含載體和檢測層，其中檢測層通常含有酶。對于測試元件的適當功能具有決定性的是這些酶在儲存期間和處理之后保持生物學活性。由于對單次測量進行校準通常是不可能的，測試元件通常分批校準。一批測試元件的校準信息被儲存并被用于該批次的每個元件，而不管處理和儲存中的個體差異。

但是，測試元件的預處理和儲存條件可能嚴重影響酶活性。例如，測試元件的制造或儲存過程中的熱處理都可以使酶變性，使得測試元件上存在的總酶活性顯著降低，這進而在使用該測試元件時導致錯誤的測試結果。類似地，許多酶對于氧化過程敏感，這也會導致變性和不可逆的酶失活。但是，測試元件上的許多酶，至少在儲存期間是存在于無溶劑的環境中，這可能甚至促進了這種氧化過程。而且，檢測層可能包含更利于氧化過程的其它組分，例如氧化還原輔因子和其它氧化還原相關組分等。

但是，在這種不利條件下保護酶活性的問題，不僅僅應用于測試元件。而更常見地，許多酶制劑是以基本上無溶劑的形式，例如凍干制劑的形式被提供和儲存的。

已對各種所謂的相容性溶質，即不同化學分類的低分子化合物，例如糖、多元醇、游離氨基酸、氨基酸衍生物、胺和硫類似物、硫酸酯、短肽和環2,3-二磷酸甘油酸酯對于它們在溶液中和干燥條件下的蛋白質的保護性質進行了研究(參見Arakawa?1985,?Biophys?J?47:?411;?Lippert?1992,?Appl?Microbiol?Biotechnol?37:?61;?G?ller?1999,?J?Mol?Catal?B?Enzymatic?7:37;?Lentzen?2006,?Appl?Microbiol?Biotechnol?72:?623;?WO2007/002657,?US2010/0255120)。

在用于對溶液中的葡萄糖進行電化學測定的傳感器中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶對于葡萄糖氧化酶的穩定作用先前已有報道(WO2007/097653;?Loose?2006,?Proceedings?of?the?24^th?IASTED?International?Multi-conference?Biomedical?Engineering,?167-173,?Innsbruck,?AT)。但是，已知葡萄糖氧化酶是一種對于氧化脅迫和熱而言相當穩定的酶。另一方面，羥基四氫嘧啶被報道對于乳酸脫氫酶來說不能防止蛋白質在溶液中聚集(Andersson?2000,?Biotechnol?Appl?Biochem?32:?145-153)。通常脫氫酶以及，特別是葡萄糖脫氫酶對于氧化脅迫和熱處理是相當敏感的酶。然而，它們是重要的診斷工具。

四氫嘧啶還被報道在包含膽固醇脫氫酶針對酶活性進行電化學檢測的膽固醇生物傳感器中作為試劑(WO2007/132226或WO2006/067424)。

但是，存在對儲存和溫度敏感酶類的酶活性進行保護的需要，所述酶用于診斷應用，并且特別用于脫氫酶類別例如葡萄糖脫氫酶。

本發明所基于的技術問題可以被視為是提供了迎合上述需要的工具和方法。所述問題由權利要求中和本文下述表征的實施方案解決。

因此，本發明涉及干燥組合物，其包含以下組分：

(a)?脫氫酶；

(b)?氧化還原輔因子；

(c)?在存在氧化還原當量的條件下能引起指示劑的光學性質的至少一種變化的試劑；

(d)?指示劑；以及

(e)?至少一種相容性溶質，其是四氫嘧啶或其衍生物。