[發明專利]重組固氮微生物及其用途

有效

• 申請號: 201380012076.X
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN104204211B
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 希倫德拉·庫馬爾·達斯;馬德胡麗卡·斯里瓦斯塔瓦;烏米什·庫馬爾·巴蓋斯赫瓦爾
• 申請（專利權）人: 科技部生物技術局;尼赫魯大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C07K14/195;C05F11/08
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙)11413
• 代理人: 全萬志,劉繼富

1.一種重組微生物，其包含經破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動子的染色體nifA基因，其中所述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標記基因，其中所述微生物是固氮菌，其中所述組成型異種啟動子是如SEQ ID NO.：6中所列出的含有組成型sigma-70啟動子/pBR322的tet啟動子的375bp EcoRI-BamHI片段。

2.權利要求1所述的重組微生物，其中所述固氮菌選自圓褐固氮菌、棕色固氮菌、Azotobacter armenaicus、拜葉林克氏固氮菌、Azotobacter nigricans和雀稗固氮菌。

3.權利要求1所述的重組微生物，其中所述nifL基因通過靶標基因破壞而被破壞。

4.權利要求3所述的重組微生物，其中所述靶標基因破壞通過插入誘變、刪除基因組DNA進行。

5.權利要求3所述的重組微生物，其中所述靶標基因破壞通過引入游離的載體進行。

6.一種重組DNA分子，其包含經破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動子的染色體nifA基因，其中所述組成型異種啟動子是如SEQ ID NO.：6中所列出的含有組成型sigma-70啟動子/pBR322的tet啟動子的375bp EcoRI-BamHI片段。

7.一種重組載體，其包含權利要求6所述的重組DNA分子。

8.一種用于制備重組微生物的方法，其中所述方法包括：

(a)通過與包含經破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動子的nifA基因、和抗生素抗性標記基因的重組DNA分子的同源重組，將經破壞的nifL基因和nifA基因插入到所述微生物的染色體中以獲得經轉化的微生物，其中所述nifL基因是通過靶標基因破壞而被破壞的；

(b)通過與包含組成型異種啟動子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動子插入至所述經轉化的微生物的nifA基因的上游，以獲得包含經破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動子的nifA基因的重組微生物；

其中所述重組微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標記基因，其中所述微生物是固氮菌，其中所述組成型異種啟動子是如SEQ ID NO.：6中所列出的含有組成型sigma-70啟動子/pBR322的tet啟動子的375bp EcoRI-BamHI片段。

9.權利要求8所述的方法，其中所述靶標基因破壞通過插入誘變、刪除基因組DNA進行。

10.權利要求8所述的方法，其中所述靶標基因破壞通過引入游離的載體進行。

11.權利要求9所述的方法，其中所述插入誘變是通過插入子插入來進行的。

12.一種重組微生物，其通過權利要求8所述的方法制備。

13.一種用于制備能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮的重組固氮菌的方法，其中所述方法包括：

(a)提供包含經破壞的nifL基因和具有天然啟動子的nifA基因的重組DNA結構，其中所述nifL基因是通過插入子插入而被破壞的，

(b)通過用步驟(a)的所述重組DNA結構轉化固氮菌細胞的同源重組，將經破壞的nifL基因和具有天然啟動子的nifA基因插入至微生物的染色體中，

(c)選擇經轉化的固氮菌，其中所述經轉化的固氮菌不能固定大氣氮，

(d)通過與包含組成型異種啟動子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動子插入至所述經轉化的固氮菌的nifA基因的上游以獲得包含經破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動子的nifA基因的重組固氮菌，和

(e)在缺少氮源的營養培養基上選擇來自步驟(d)的重組固氮菌，

其中所述重組固氮菌能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標記基因，其中所述組成型異種啟動子是如SEQ ID NO.：6中所列出的含有組成型sigma-70啟動子/pBR322的tet啟動子的375bp EcoRI-BamHI片段。

14.一種根據權利要求13所述的方法獲得的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標記基因。