[發明專利]一種抗草甘膦融合蛋白及其編碼基因、產生方法與應用

有效

• 申請號: 201380008110.6
• 申請日: 2013-08-26
• 公開（公告）號: CN104684934B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 崔洪志;何云蔚;王建勝;孫超;王君丹
• 申請（專利權）人: 創世紀種業有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/22;C12N9/00;A01H5/00;C12N15/82;C12N5/10;C12N15/62
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司11285
• 代理人: 張廣育,姜建成

技術領域

本發明涉及融合蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種融合的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)及其編碼基因、獲得該融合蛋白的方法及其在培育抗草甘膦植物中的應用。

背景技術

草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有理化性質穩定、高效、廣譜、低毒、低殘留、易于被微生物分解、不破壞土壤環境等優點，已廣泛應用于農業生產中，成為目前世界上生產量最大的農藥品種。草甘膦的作用機理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。該酶是真菌、細菌、藻類和高等植物體內芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過程中的一個關鍵酶，其具有由兩個保守的亞基組成的啞鈴狀結構。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似物，是競爭性EPSPS抑制劑，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)結合形成EPSPS-S3P-草甘膦復合體(此復合體非常穩定)，抑制EPSPS的活性導致分支酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最終導致一些激素和關鍵性代謝物如類黃酮、木質素和酚類化合物代謝失調，從而擾亂生物體正常的氮代謝而使其死亡。

1976年，美國孟山都公司的草甘膦類除草劑-農達(Roundup)研制成功并得到廣泛應用。隨著植物基因工程技術的發展和應用，抗草甘膦除草劑的轉基因作物研究已成為熱點。目前，轉EPSPS基因的抗草甘膦除草劑轉基因作物已經在多個國家廣泛應用。

目前利用EPSPS基因開展植物抗草甘膦研究主要有兩種方法：

第一種，是在植物中過量表達EPSPS，并以此拮抗草甘膦的競爭性抑制。Amrhein等通過逐漸增加草甘膦的濃度，加大草甘膦的選擇壓力，分離獲得了一個耐草甘膦的矮牽牛細胞系。分析這個細胞系中的EPSPS基因，發現該細胞系的基因組中EPSPS基因的拷貝數擴增了20倍，使該酶的產量大大增加(Amrhein N,Johanning D,et al.Biochemical basis for glyphosate-tolerance in a bacterium and plant tissue culture.FEBS Lett.,1983,157:191-196)。

第二種，是使EPSPS發生突變，使其在保持催化活性的同時降低對草甘膦的親和性，甚至不親和。Stalker等從鼠傷寒沙門氏菌中分離到對草甘膦表現抗性的菌株，研究發現EPSPS的第101位的脯氨酸殘基變為絲氨酸殘基,將突變體編碼基因轉入煙草后可使轉基因煙草對草甘膦的抗性提高(Stalker DM,Hiatt WR,et al.A amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate.J Biol Chem,1985,260:4724-4728)；Padgette等將來自大腸桿菌的aroA基因編碼的EPSPS的第96位的甘氨酸殘基突變為丙氨酸殘基，結果發現突變蛋白對草甘膦的結合活性顯著降低，將編碼該突變蛋白的基因在矮牽牛中表達后可顯著提高其對草甘膦的抗性(Padgette SR,Re DB,Gasser CS,et al.Site-directed mutagenesis of a conserved region of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site.J Biol Chem,1991,266:22364-22369)；朱楨等(2005，專利申請號：200510002739.7)通過易錯PCR(Error-Prone PCR)方法獲得水稻的抗草甘膦突變體，其EPSPS的第106位氨基酸殘基由脯氨酸殘基變為亮氨酸殘基；Michael Spnecer等將玉米EPSPS第102位的蘇氨酸殘基突變為異亮氨酸殘基，第106位脯氨酸殘基突變為絲氨酸殘基，使含有該突變的EPSPS的編碼基因的植株獲得抗除草劑特性(美國專利號：6040497)。本申請人曾將來自棉花的EPSPS第101位蘇氨酸殘基定點突變為異亮氨酸殘基，第105位脯氨酸殘基改變為絲氨酸殘基，獲得可提供一定草甘膦抗性的EPSPS突變基因(PCT/CN2010/078327)。