[發明專利]化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段及其表達、應用

有效

• 申請號: 201310754300.4
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103834667A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 李越希;陳樂如;蔡冉;周潔;張素芬;許桂麗;馬穎;袁敬宇;李素芹;潘英;李丙軍;徐悅玥
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/315;C07K1/22;C07K16/12;G01N33/68;C12R1/46
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

1.一種化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白的胞外區基因片段，該基因片段編碼含強抗原表位肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段，即第33個氨基酸至第109個?氨基酸，共77個氨基酸，在該基因片段的5'端增加了BamHI酶切位點（下劃線部分），在3'端增加了終止密碼子TGA和EcoRI酶切位點（下劃線部分），化學合成的基因序列全長246bp，序列如下：

GGATCC?GAA?GCC?CCG?GTT?GCC?AGC?CAA?TCG?AAG?GCG?GAA?AAA?GAC?TAC?GAC?GCA?GCC?GTG?AAG?AAA?AGC?GAA?GCA?GCG?AAA?AAA?GCA?TAC?GAA?GAA?GCA?AAA?AAG?AAA?GCG?GAA?GAT?GCC?CAG?AAG?AAA?TAC?GAT?GAA?GAC?CAA?AAG?AAA?ACC?GAA?GAA?AAA?GCG?GAA?AAC?GAA?AAG?AAA?GCG?GCG?GCA?GAC?CTG?AAT?GAA?GCG?ACC?GAA?GTC?CAT?CAA?AAG?GCG?TAT?GTG?CGT?TAC?TAA?CTCGAG

權利要求1所述的化學合成的基因片段，采用基因工程技術表達該基因序列編碼的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段，純化表達的蛋白片段，具體方法如下：

表達肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段重組質粒的構建:

用?Bam?HI和EcoR?I雙酶切質粒pGEX4T-2和化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段，電泳回收后，用T4?DNA?連接酶連接，使肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段插入到載體pGEX4T-2內的BamH?I和EcoR?I位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白，全長303個氨基酸,該融合蛋白N端融合了載體上的226個氨基酸，C端包含肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段，電泳回收后，用T4?DNA?連接酶連接，使肺炎鏈球菌PspA蛋白內的第33個氨基酸至第109個氨基酸鏈接到載體質粒，全長氨基酸序列如下：

表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定:

　　將重組質粒轉化E.?coli?BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨芐青霉素的LB平板，置37℃?過夜，次日隨機挑取轉化菌落和含質粒pGEX4T-2的對照菌，提取質粒?，用限制性內切酶BamHI和XhoI對質粒雙酶切，1.0％的Agarose凝膠檢測雙酶切產物應切下約220bp的基因片段。

2.將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含氨芐青霉素100μg／mL?的LB培養基內，37℃振蕩培養3h，加IPTG至終濃度0.5?～1.0?mmol/L,繼續振蕩培養誘導4～6h，?離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測,重組子表達相對分子量約為32kD的肺炎鏈球菌PspA蛋白，表達量約為30%，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶；

表達肺炎鏈球菌PspA蛋白的純化:

將誘導表達融合蛋白的工程菌離心收菌，菌體重懸于裂解液內，裂解液為50?mmol/L?Tris-HCl?pH8.0、10?mmol/L?EDTA、10?mmol/L　DTT，超聲破菌10?min，離心收集上清，上清溶液加已經平衡的Glutathione?Sepharose?4B凝膠3ml,室溫結合60min,上樣，收集穿透液；用十倍柱床體積的1×PBS洗滌柱子，接著用15ml高濃度的GSH洗脫液（50?mmol/L?Tris-HCl?pH8.0+10?mmol/L?GSH）分三次洗脫目的蛋白,即為純化的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區片段。

3.權利要求1所述的化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區的基因片段序列，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表達、制備。

4.權利要求2或權利要求3所述的方法制備的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區片段，用于肺炎鏈球菌感染抗體的檢測及單抗和多抗的制備。