[發明專利]化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段及其表達、應用

有效

• 申請號: 201310754300.4
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103834667A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 李越希;陳樂如;蔡冉;周潔;張素芬;許桂麗;馬穎;袁敬宇;李素芹;潘英;李丙軍;徐悅玥
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/315;C07K1/22;C07K16/12;G01N33/68;C12R1/46
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術領域

本發明化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段及其表達、應用涉及的是一種肺炎鏈球菌表面蛋白A抗原片段的表達、純化及應用，通過化學合成肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA蛋白)全新基因片段，利用基因工程技術，制備重組蛋白。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位肺炎鏈球菌PspA蛋白的片段，選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達，表達的蛋白可用于肺炎鏈球菌感染抗體的檢測及單克隆抗體的制備等，本發明涉及基因工程技術和檢測試劑領域。

背景技術

肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae）簡稱肺炎球菌（pneumococcus）。為革蘭染色陽性菌。肺炎鏈球菌會導致不同種類的疾病，包括有急性鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窩組織炎及腦膿腫。

目前針對肺炎鏈球菌感染的主要檢測方法有：細菌學分離法，酶聯免疫法(ELISA)?，DNA探針及PCR技術等。但這些方法或多或少都存在著實驗時間長，不適合現場快速檢測等缺點。近年來，免疫金標層析技術在生物醫學各領域得到了廣泛的應用，為肺炎鏈球菌的檢測提供了新的思路。篩選肺炎鏈球菌外膜特異性抗原，并制備高純度的特異性抗原，是建立該技術的重要前提。

肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)是肺炎鏈球菌重要的毒力因子，在所有臨床分離的肺炎鏈球菌中均發現它的存在。PspA主要有五個域組成：一個信號肽，一個α螺旋區，一個脯氨酸富集區，一個膽堿結合區和一個C端尾巴。研究表明，PspA蛋白在不同血清型菌株中有廣泛的同源性，但其α螺旋區存在較大的變異性。

發明內容

本發明目的是通過化學合成的截短的PspA蛋白的全新基因片段，利用基因工程技術，制備PspA蛋白高表達片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的PspA蛋白胞外區片段,第33個氨基酸－第109個?氨基酸，共77個氨基酸，選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達該基因。表達的蛋白可用于肺炎鏈球菌感染抗體的檢測或單克隆細胞株的制備。

化學合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區基因片段及其表達、應用是采取以下步驟實現的：

1．PspA蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成：

利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析的氨基酸序列，發現PspA蛋白含有較強的抗原決定簇，選擇第33個氨基酸－第109個氨基酸作為研究對象。選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位點（下劃線部分），在3'端增加了終止密碼子（TAA）和EcoRI酶切位點（下劃線部分），使該基因片段易于克隆至質粒pGEX4T-2內的BamHI和EcoRI酶切位點內。

篩選的PspA蛋白片段氨基酸序列（第33個aa?－?第109個aa）：

化學合成的PspA基因片段的DNA?序列（246?bp）：

GGATCC?GAA?GCC?CCG?GTT?GCC?AGC?CAA?TCG?AAG?GCG?GAA?AAA?GAC?TAC?GAC?GCA?GCC?GTG?AAG?AAA?AGC?GAA?GCA?GCG?AAA?AAA?GCA?TAC?GAA?GAA?GCA?AAA?AAG?AAA?GCG?GAA?GAT?GCC?CAG?AAG?AAA?TAC?GAT?GAA?GAC?CAA?AAG?AAA?ACC?GAA?GAA?AAA?GCG?GAA?AAC?GAA?AAG?AAA?GCG?GCG?GCA?GAC?CTG?AAT?GAA?GCG?ACC?GAA?GTC?CAT?CAA?AAG?GCG?TAT?GTG?CGT?TAC?TAA?CTCGAG

2．表達PspA蛋白胞外區片段重組質粒的構建:

提取質粒pGEX4T-2,用?Bam?HI和EcoR?I雙酶切，電泳后回收酶切的質粒大片段,?溶于去離子水內。同樣用BamHI和EcoR?I雙酶切化學合成的PspA基因片段，電泳回收后,?溶于去離子水內。