[發(fā)明專利]化學(xué)合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310754300.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103834667A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李越希;陳樂(lè)如;蔡冉;周潔;張素芬;許桂麗;馬穎;袁敬宇;李素芹;潘英;李丙軍;徐悅玥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李越希
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/70;C07K14/315;C07K1/22;C07K16/12;G01N33/68;C12R1/46
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明化學(xué)合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用涉及的是一種肺炎鏈球菌表面蛋白A抗原片段的表達(dá)、純化及應(yīng)用，通過(guò)化學(xué)合成肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA蛋白)全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組蛋白。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位肺炎鏈球菌PspA蛋白的片段，選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)的蛋白可用于肺炎鏈球菌感染抗體的檢測(cè)及單克隆抗體的制備等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和檢測(cè)試劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae）簡(jiǎn)稱肺炎球菌（pneumococcus）。為革蘭染色陽(yáng)性菌。肺炎鏈球菌會(huì)導(dǎo)致不同種類的疾病，包括有急性鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窩組織炎及腦膿腫。

目前針對(duì)肺炎鏈球菌感染的主要檢測(cè)方法有：細(xì)菌學(xué)分離法，酶聯(lián)免疫法(ELISA)?，DNA探針及PCR技術(shù)等。但這些方法或多或少都存在著實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，免疫金標(biāo)層析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，為肺炎鏈球菌的檢測(cè)提供了新的思路。篩選肺炎鏈球菌外膜特異性抗原，并制備高純度的特異性抗原，是建立該技術(shù)的重要前提。

肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)是肺炎鏈球菌重要的毒力因子，在所有臨床分離的肺炎鏈球菌中均發(fā)現(xiàn)它的存在。PspA主要有五個(gè)域組成：一個(gè)信號(hào)肽，一個(gè)α螺旋區(qū)，一個(gè)脯氨酸富集區(qū)，一個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)和一個(gè)C端尾巴。研究表明，PspA蛋白在不同血清型菌株中有廣泛的同源性，但其α螺旋區(qū)存在較大的變異性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是通過(guò)化學(xué)合成的截短的PspA蛋白的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備PspA蛋白高表達(dá)片段。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，篩選出含強(qiáng)抗原表位的PspA蛋白胞外區(qū)片段,第33個(gè)氨基酸－第109個(gè)?氨基酸，共77個(gè)氨基酸，選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因。表達(dá)的蛋白可用于肺炎鏈球菌感染抗體的檢測(cè)或單克隆細(xì)胞株的制備。

化學(xué)合成的肺炎鏈球菌PspA蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用是采取以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

1．PspA蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成：

利用ANTHEWIN等軟件，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)PspA蛋白含有較強(qiáng)的抗原決定簇，選擇第33個(gè)氨基酸－第109個(gè)氨基酸作為研究對(duì)象。選擇原核生物偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位點(diǎn)（下劃線部分），在3'端增加了終止密碼子（TAA）和EcoRI酶切位點(diǎn)（下劃線部分），使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pGEX4T-2內(nèi)的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)內(nèi)。

篩選的PspA蛋白片段氨基酸序列（第33個(gè)aa?－?第109個(gè)aa）：

化學(xué)合成的PspA基因片段的DNA?序列（246?bp）：

GGATCC?GAA?GCC?CCG?GTT?GCC?AGC?CAA?TCG?AAG?GCG?GAA?AAA?GAC?TAC?GAC?GCA?GCC?GTG?AAG?AAA?AGC?GAA?GCA?GCG?AAA?AAA?GCA?TAC?GAA?GAA?GCA?AAA?AAG?AAA?GCG?GAA?GAT?GCC?CAG?AAG?AAA?TAC?GAT?GAA?GAC?CAA?AAG?AAA?ACC?GAA?GAA?AAA?GCG?GAA?AAC?GAA?AAG?AAA?GCG?GCG?GCA?GAC?CTG?AAT?GAA?GCG?ACC?GAA?GTC?CAT?CAA?AAG?GCG?TAT?GTG?CGT?TAC?TAA?CTCGAG

2．表達(dá)PspA蛋白胞外區(qū)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建:

提取質(zhì)粒pGEX4T-2,用?Bam?HI和EcoR?I雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段,?溶于去離子水內(nèi)。同樣用BamHI和EcoR?I雙酶切化學(xué)合成的PspA基因片段，電泳回收后,?溶于去離子水內(nèi)。