[發明專利]一種穩定、新型的過氧化物酶測定用顯色液

有效

• 申請號: 201310756623.7
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN104132936B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 劉遵峰;劉倩;種玉婷;賈鳳美
• 申請（專利權）人: 常州碳宇納米科技有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于生物化學試劑領域，具體涉及一種過氧化物酶測定用顯色液，及其制備方法。

背景技術：

在多數檢測中，過氧化物和顯色的電子供體與樣品中的分析物反應，此分析物可能是催化劑(如法醫樣品、血漿、尿液、血色素等)，或與催化劑相關的物質(酶標過氧化物酶)。如樣品中含有此分析物，則發生氧化反應，并在幾秒到幾小時內發生可見的顯色反應。過氧化活性檢測也適用于規定在濾膜、細胞或組織切片、電泳凝膠、雜交斑點上分析物的定位分析。

所謂過氧化物酶，通常來源于辣根，因此常被稱辣根過氧化物酶，是臨床和科研檢驗試劑中的常用酶。過氧化物酶作為多種試劑盒顯色體系的關鍵成分，對試劑盒的作用有重要影響。過氧化物酶顯色液是免疫學、免疫組織化學、生物化學等檢測以及研究領域常用的顯色體系。目前在科研、乃至臨床醫學都有廣泛的應用。

過氧化物酶顯色液的工作原理簡單描述如下：

過氧化物(常用的如過氧化氫)在過氧化物酶的作用下發生分解反應，并釋放氧化態氧(O-)，O-與顯色體系中的供氧體(一般為無色，常用的有TMB、DAB)發生氧化還原反應，生色物被氧化，氧化態的生色物產生特定的顏色。反應完成后，顯色體系深淺可以直接指示反應體系中被檢測物質的含量，從而實現定性或者定量的檢測。然而，雙氧水中的氧元素化合價是-1價，-1價的氧不是氧元素的穩定狀態，即使無過氧化物酶的情況下，雙氧水也會發生分解，從而降低過氧化活性檢測的準確性。因此，尋求穩定性好的過氧化物意義重大。

氧化石墨烯是近幾年研究比較多的材料，一般由石墨經強酸氧化而得。經過氧化處理后，氧化石墨仍保持石墨的層狀結構，但在每一層的石墨烯單片上引入了許多氧基功能團。這些氧基功能團的引入使得單一的石墨烯結構變得非常復雜。氧化石墨烯是單一的原子層，可以隨時在橫向尺寸上擴展到數十微米，因此，其結構跨越了一般化學和材料科學的典型尺度。氧化石墨烯可視為一種非傳統型態的軟性材料，具有聚合物、膠體、薄膜，以及兩性分子的特性。氧化石墨烯長久以來被視為親水性物質，因為其在水中具有優越的分散性，但是，相關實驗結果顯示，氧化石墨烯實際上具有兩親性，從石墨烯薄片邊緣到中央呈現親水至疏水的性質分布。因此，氧化石墨烯可如同界面活性劑一般存在界面，并降低界面間的能量。

基于以上技術背景，發明人認為：氧化石墨烯具備巨大的比表面積、優異的水溶性，同時穩定性很好，可以作為一種新型的過氧化物，替代傳統的過氧化氫。

發明人為了實現上述問題進行了長時間的研究和驗證，結果發現：是用氧化石墨烯的水溶液作為過氧化物，在很大的濃度范圍內，都可以和顯色的電子供體與樣品中的分析物發生氧化反應，并在幾秒到幾小時內發生可見的顯色反應。

發明內容：

本發明的目的在于用比表面積大、穩定性好的氧化石墨烯替代傳統顯色液中的過氧化氫，以解決過氧化氫不穩定，遇光照、金屬離子等易分解的問題，得到了一種穩定、新型的過氧化物酶顯色液。

本發明選用兩種常見的顯色液為研究對象，即DAB顯色液(DAB-H₂O₂)和TMB顯色液(TMB-H₂O₂)，以氧化石墨烯替代這兩種顯色液中的過氧化氫，得到新型DAB顯色液(DAB-CO)和新型TMB顯色液(TMB-CO)。

所述DAB-CO顯色液由DAB，Na₂HPO₄·12H₂O，檸檬酸和氧化石墨烯溶液組成，生色物質DAB，即3，3-四鹽酸二氨基聯苯胺，其濃度分別為0.2-0.6mg/ml，最好為0.4mg/ml，Na₂HPO₄·12H₂O濃度為15-20mg/ml，最好為18mg/ml，檸檬酸濃度為：4-5mg/ml，最好為4.5mg/ml。

所述TMB-CO顯色液由TMB，EDTA，甘油，檸檬酸和氧化石墨烯溶液組成，生色物質TMB即四甲基聯苯胺，不易溶于水，使用時先將其溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，再用檸檬酸緩沖液配成儲存液，TMB在顯色液中的濃度為0.1-0.2mg/ml，最好為0.15mg/ml。EDTA為金屬離子螯合劑，能作用緩沖液中的重金屬離子，消除重金屬離子對過氧化物催化作用的影響，EDTA在顯色液中的濃度為0.1-0.3mg/ml，最好為0.2mg/ml。顯色液中甘油的濃度最好為3-8％，最好為5％。檸檬酸作為顯色液的緩沖物質，其濃度為0.7-1.2mg/ml，最好為0.9mg/ml。