[發(fā)明專利]一種高效擴增CD3-CD56+的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310755088.3
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103756964A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李廼昶;任峰
• 申請（專利權(quán)）人: 天津斯坦姆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 董一寧

1.一種高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟如下：

⑴抗HER2單抗包被

用PBS稀釋抗HER2單抗，包被T75培養(yǎng)瓶，抗HER2單抗的濃度為10-50ug/cm²，置4℃冰箱過夜，吸棄培養(yǎng)瓶中的稀釋液待用；

⑵自體血清的制備

采外周血經(jīng)Ficoll分離，獲得正常血漿，56℃滅活、離心后得到血清，置4℃冰箱儲存待用；

⑶NK細胞的活化

采外周血經(jīng)Ficoll分離獲得外周血單個核細胞，用無血清培養(yǎng)基AIM-V調(diào)整外周血單個核細胞的濃度至少1×10⁶個/ml，然后加入AIM-V20ml，AIM-V中內(nèi)含細胞因子IL-2500-1000u/ml、IL-15?10-20ng/ml和IL-21?5-10ng/ml，再加入體積百分?jǐn)?shù)5-10%的血清，記為第0天；

⑷NK細胞的擴增

培養(yǎng)的第3、5、7天補充無血清培養(yǎng)基AIM-V，依次加入40ml、140ml、400ml，并同時添加細胞因子IL-2?500-1000u/ml、IL-15?10-20ng/ml和IL-21?5-10ng/ml和5-10%（體積百分?jǐn)?shù)）血清，進行擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后，即得CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑴中抗HER2單抗為重組DNA衍生的人源化單克隆抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述重組DNA衍生的人源化單克隆抗體是由懸養(yǎng)于無菌培養(yǎng)基中的哺乳動物細胞產(chǎn)生，經(jīng)親合色譜法、離子交換法純化和病毒滅活的去除程序獲得的。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑴中抗HER2單抗的濃度為30ug/cm²。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑵中外周血為人的外周血。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑶中外周血為人的外周血。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴增CD3^-CD56⁺的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑵和⑶中細胞因子IL-2、IL15和IL-21的添加量為IL-2?1000u/ml、IL-1520ng/ml和IL-21?10ng/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴增CD3-CD56+的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑶或⑷中血清為人自體血清。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴增CD3-CD56+的自然殺傷細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑵中血清為人自體血清。