[發明專利]一種用于具有細胞膜結構的生物體的熒光標記方法

在審

• 申請號: 201310754554.6
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN104749369A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發明（設計）人: 馬軼凡;潘宏;張鵬飛;李文軍;蔡林濤
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于生物標記技術領域，尤其涉及一種用于具有細胞膜結構的生物體的熒光標記方法。

背景技術

目前，細胞治療（包括干細胞和免疫細胞）被廣泛用于腫瘤、自身免疫病、移植等多個臨床治療領域。研究細胞在體內的遷移和分布，對于細胞治療的臨床應用和提升至關重要?，F有的細胞標記方法，主要是通過熒光染料、抗體（免疫學熒光標記）、報告基因和熒光素等相關標記技術來研究細胞形態、細胞融合、細胞動力學、細胞遷移等細胞功能，并且一些技術需要結合組織病理學相關切片技術，在不同時間點將組織從動物中取出進行切片，染色標記，研究目標細胞在某個時間點在體內各種生理變化情況。然而這種標記細胞的方法卻無法實現對活細胞在體內的實時跟蹤，限制了靶細胞在活體內的研究。為解決傳統示蹤方法的不足，急需研究開發出能用于活體示蹤的活細胞標記方法，采用這些方法可對同一實驗對象在不同時間點進行比較，標記跟蹤活細胞在體內的遷移及相關變化，所得的數據信息更加詳盡。這明顯減少了實驗動物數量，同時又為細胞與醫藥研究領域提供了指導。而這種動態的活體示蹤，需要開發出一種高效，穩定的活細胞標記技術來實現。

運用于活細胞的標記方法主要有：熒光染料標記，熒光素和熒光蛋白，普通量子點活細胞示蹤以及一些光學成像等影像技術，但由于它們都有各自的缺陷，每種單一成像模式都不能提供完美的光學信號。其中，目前的量子點活細胞示蹤技術，是通過細胞吞噬，或載體攜帶進入細胞，會對細胞的生理活性產生影響，不利于目標細胞研究。普通光學成像是運用生物發光劑（染料）和內源性熒光報告基因或者是運用外源性探針檢測分子監測目標物的生化過程，但都有其固有的局限性，在可見光范圍內光子容易被組織吸收和散射，很難穿透深層組織，因而只能用于體外研究或者不能實時動態觀察靶細胞。在影像學領域中急切需要研究出一種標記簡單，穿透力強，光學分辨率高的無創傷的標記/示蹤方法。近年來，近紅外熒光成像技術已經被廣泛應用，其基本原理是以特定波譜范圍的激發光源照射近紅外熒光探針，此時熒光探針會被激發出不同光譜特性的光子信號。與可見光相比近紅外熒光可穿透更深層的組織，特異性強，靈敏度高的特點，在體內外標記示蹤過程有著廣泛的應用前景。

現有熒光標記技術中，將熒光探針與生物分子結合的方式主要基于非共價的連接方式，這種方法雖然相對簡便快捷，但得到的熒光標記生物分子不夠穩定，示蹤時間短，在應用上有很大限制。另一種連接方式是運用羧基與氨基間的縮合反應，可實現對生物分子的熒光標記。盡管這種方法是利用共價鍵的結合方式獲得較為穩定的標記產物，但這類標記方法通常需要特定的催化劑進行催化，這給該方法的應用推廣帶來困難。而且在含有蛋白的生物分子和環境中，通常會存在有大量的氨基和羧基等基團，這使得染料和量子點熒光標記的特異性出現降低，同時還會影響對目標生物分子的標記效率。因此，為解決上述問題，以點擊化學反應為基礎將熒光探針標記到生物體上已開始應用于生物標記領域，因其共價鍵連接非常穩定，而且由于生物體系中不含有環炔基和疊氮基團，而點擊化學反應中，只有含有疊氮基的細胞能和帶有環炔基的染料或量子點反應，反應速度較快，不受反應體系中的其他因素干擾，具有很強的高效性與特異性。

通常，以點擊化學為基礎的熒光標記方法采用兩步法，首先使細胞與帶有環炔基的點擊化學修飾連接劑結合，然后用疊氮-熒光標記物復合物對細胞進行熒光標記。但是，這種標記方法對細胞毒性大從而對細胞的活性影響較大，活性低不利于生物活體標記和檢測。而且兩步法標記比較繁瑣，效率低。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種用含有疊氮基團的膽堿類似物修飾具有細胞膜結構的生物體的熒光標記方法，以解決現有的以點擊化學為基礎的熒光標記方法對生物體活性影響較大的技術問題。

進一步地，本發明的目的在于提供一種操作簡單、效率高的一步法熒光標記，以解決現有的兩步法標記操作繁瑣、效率低的技術問題。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種用于具有細胞膜結構的生物體的熒光標記方法，包括以下步驟：

將含有疊氮基團的膽堿類似物和具有細胞膜結構的生物體共培養，經新陳代謝后得到膽堿類似物修飾的生物體；

通過點擊化學反應，用DBCO基團修飾的熒光標記物對所述膽堿類似物修飾的生物體進行標記，使得熒光標記物標記在生物體的細胞膜表面。