[發明專利]電荷?質量雙聚焦二維凝膠電泳分離方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201310754419.1
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103694329B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 鐘鴻英;張文洋;唐雪妹;鄭石;黃璐璐
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/26
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司42102
• 代理人: 喬宇

技術領域

本發明屬于蛋白凝膠電泳分離領域，具體涉及電荷-質量雙聚焦二維凝膠電泳分離方法及其試劑盒。

背景技術

組蛋白是真核細胞染色質中的堿性蛋白，也表觀遺傳的物質基礎，大量研究表明組蛋白與許多人類重大疾病的發生發展密切相關，因此組蛋白的分離和鑒定對認識基本生理病理過程具有重要意義。然而，各種組蛋白異構體結構非常相似，而且存在大量翻譯后修飾，這使分析技術面臨很大挑戰。

現有的凝膠電泳技術中，一般采用等電點聚焦進行第一維分離，再采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行第二維質量分離。等電點聚焦的缺點主要有兩個方面：(1)堿性蛋白的分辨能力差；(2)蛋白質容易沉淀。而且，組蛋白不同異構體的分子量非常相似，這使得第二維的質量分離能力也受到影響。

發明內容

本發明的發明目的是針對現有技術的不足，提供電荷-質量聚焦二維凝膠電泳分離方法及其試劑盒。本發明所述電泳分離方法可以將組蛋白異構體從蛋白樣品中有效的分離出來。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

電荷-質量雙聚焦二維凝膠電泳分離方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)組蛋白生物樣品預處理：配制樣品質子化緩沖溶液，將組蛋白生物樣品溶解于所述樣品質子化緩沖溶液中，得到質子化組蛋白生物樣品溶液；再向質子化組蛋白生物樣品溶液中加入CuSO₄溶液，使Cu²⁺與組蛋白充分結合，得到組蛋白生物樣品上樣液；

(2)第一維電荷電泳分離：制備吐溫-醋酸-尿素濃縮膠和吐溫-醋酸-尿素分離膠，采用常規電泳系統進行第一維電荷電泳分離，將步驟(1)得到的組蛋白生物樣品上樣液加樣至上樣口，施加電壓開始電泳，電泳結束后，得到第一維電荷電泳分離凝膠膠條；

(3)將步驟(2)得到的第一維電荷電泳分離凝膠膠條進行脫色和染色后得到第一維電荷電泳分離電泳圖；或者將步驟(2)得到的第一維電荷電泳分離凝膠膠條切下后橫放于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠上，加入指示劑，進行第二維SDS-PAGE質量電泳分離，電泳結束后，得到電荷-質量二維電泳分離凝膠膠條，所述電荷-質量二維電泳分離凝膠膠條經染色和脫色后得到電荷-質量二維電泳分離凝膠電泳圖。

上述方案中，所述樣品質子化緩沖溶液的各組分配比為：尿素0.36g，冰醋酸50μl，0.2wt％派洛寧Y溶液60μl，加水定容至600μl。

上述方案中，所述質子化組蛋白生物樣品溶液配制過程中每1mg組蛋白生物樣品所需要的樣品質子化緩沖溶液的體積為200～1000μl。

上述方案中，所述CuSO₄溶液的濃度為40μg/μl，所述CuSO₄溶液與組蛋白質子化生物樣品溶液按照質量比為1～5:1的比例混合。

上述方案中，步驟(2)所述的第一維電荷電泳分離的電泳條件為：首先采用30伏電壓運行1小時，待上樣液濃縮成一條直線后，再采用100伏電壓運行150分鐘。

上述方案中，步驟(2)中所述吐溫-醋酸-尿素濃縮膠的各組分配比為：含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉雙丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250μl、蒸餾水2.8ml、四甲基二乙胺30μl和10wt％過硫酸銨140μl；步驟(2)中所述吐溫-醋酸-尿素分離膠的各組分配比為：尿素3.6g、含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉雙丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μl、蒸餾水3.73ml、10vt％(體積百分比)吐溫370μl、四甲基二乙胺60μl和10wt％過硫酸銨280μl。

上述方案中，步驟(2)所述第一維電荷電泳分離的電泳液為5vt％醋酸水溶液。

上述方案中，將步驟(3)所述第一維電荷電泳分離凝膠膠條進行染色的染色液各組分配比為：將考馬斯藍R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考馬斯藍R250的質量濃度為0.1wt％，所述甲醇和水的體積比為1:1；將步驟(3)所述的第一維電荷電泳分離凝膠膠條進行脫色的脫色液各組分配比為：甲醇50wt％、NH₄HCO₃ 5wt％和水45wt％。

上述方案中，所述第二維SDS-PAGE質量電泳分離的電泳條件為：采用70伏電壓運行1小時，然后改變電壓至120伏繼續電泳，當指示劑跑出電泳槽，停止電泳。